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ACE2基因变异与SARS冠状病毒进入及肺部病变严重程度之间的关系研究

陈云新  
【摘要】: 严重急性呼吸综合征(severe acute respiratory syndrome,SARS)是由一种新的SARS冠状病毒(coronavirus,CoV)引起的急性传染病,在人群中传染性极强,其病死率高达10%。弥漫性肺泡损伤(diffuse alveolar damage,DAD)是导致患者出现呼衰及死亡的主要原因之一,其发病机制至今尚未阐明。在SARS-CoV被分离后不久,人们就鉴定出了SARS受体—血管紧张素转换酶2(angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)。体外研究提示,SARS假病毒在小鼠和大鼠ACE2基因转染的细胞上其病毒进入效率较人ACE2(hu-ACE2)基因转染的细胞明显降低,这些结果初步提示不同物种间ACE2基因的变异与SARS-CoV进入细胞的效率密切相关,同时这也可能是大鼠和小鼠对SARS-CoV不易感的原因之一。体内研究显示SARS-CoV感染小鼠急性期可引起ACE2表达下调;SARS-CoV S蛋白也可引起ACE2表达下调和急性肺损伤加重,运用ACE2底物抑制剂可明显减轻急性肺损伤的程度。这些研究充分体现ACE2在SARS发病过程中扮演了重要角色。但这些研究仅局限于小鼠,尚不足以外推到人。由我们以前的研究可知,中国恒河猴被SARS-CoV感染后可出现轻度或重度间质性肺炎。为了进一步明确ACE2在SARS发病中的作用,我们选择轻度和重度SARS恒河猴为研究对象,分析恒河猴ACE2(rh-ACE2)基因变异与病毒进入之间的关系。我们希望通过对rh-ACE2基因变异与病毒进入效率之间关系的研究,从而发现一些与病毒进入密切相关的氨基酸位点。进而突变hu-ACE2基因的该位点残基,观察其对病毒进入的影响,希望找到hu-ACE2上对病毒进入有重要影响的氨基酸位点。最后我们将进一步分析rh-ACE2基因突变与SARS病变严重程度之间的关系。 本次研究中我们以肺部病理变化为基础,选取6只轻度、6只重度SARS恒河猴及2只正常对照恒河猴作为研究对象。轻度肺损伤的病理特征为肺间隔增宽伴单核巨噬细胞浸润;重度肺损伤以弥漫性肺泡损伤为其特征,主要病理特征为弥漫性肺间隔增宽伴单核巨噬细胞浸润、局部肺间隔融合、肺泡腔内可见蛋白水肿液及纤维素渗出。运用RT-PCR从这些恒河猴肾组织中扩增出全长rh-ACE2基因,克隆并分析其变异规律。序列分析结果提示,在14只恒河猴中,我们共检测到55个随机非同义突变。以序列相对保守的8号恒河猴的8-2克隆为rh-ACE2代表,与hu-ACE2序列相比我们在8-2克隆的rh-ACE2序列中共查及38个一致性非同义突变。每只恒河猴选取2个代表性质粒转染HEK293T细胞后,观察基因表达水平及病毒进入效率的变化。结果发现11号恒河猴11-7克隆的ACE2表达水平和病毒进入效率较11-1克隆明显降低。序列分析结果提示,与11-1克隆相比,11-7克隆出现R192G、Y217N两个位点突变。定点突变分析显示:Y217N突变是引起rh-ACE2基因11-7克隆蛋白表达和病毒进入降低的关键性氨基酸位点。我们突变hu-ACE2基因获得hu-ACE2(Y217N)突变型质粒,转染细胞后发现hu-ACE2(Y217N)基因的表达水平和病毒进入效率较hu-ACE2基因明显下降。最后,我们分析Rh-ACE2基因变异与肺部损伤严重程度之间的关系。结果显示:有1只(1/6)轻度病变的恒河猴rh-ACE2编码区第1677位核苷酸位点存在A/G杂合性位点,有3只(3/6)重度病变的SARS恒河猴rh-ACE2编码区第1677位核苷酸位点存在A/C杂合性位点。Fisher确切概率法检验提示,轻度和重度SARS恒河猴ACE2基因第1677位核苷酸位点A/G杂合率未见明显差异。 实验结果初步提示,中国恒河猴不同个体间rh-ACE2基因氨基酸序列存在明显变异;Y217N突变可明显降低rh-ACE2和hu-ACE2的蛋白表达和SARS假病毒的进入;ACE2基因变异与SARS恒洞猴肺部病变的严重程度无明显相关。该研究将为设计针对ACE2的靶向药物及进一步理解ACE2在SARS发病中的作用提供一些线索。


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