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组织工程医用生物补片重建阴道的实验及临床研究

周慧梅  
【摘要】: 目的利用组织工程医用生物补片(国产脱细胞真皮基质材料),在实验动物小型猪体内构建阴道重建模型,并进一步进行组织学评价和功能学评价,结合临床同期观察,以期判定组织工程医用生物补片是否是阴道重建的理想材料,从而为临床人工阴道成形术开辟一条新的道路。 方法 1.选取中国小型实验猪为实验动物,制备阴道缺损及利用组织工程医用生物补片重建新阴道模型,对小型猪的围手术期和术后恢复情况以及新阴道的生长情况进行观察。 2.建模之小型猪分别于术后1周、2周、4周、6周、8周、12周不同时间段阴道全层取材,以2只小型实验猪模型构建时手术取下的正常阴道为对照,取材后行HE染色、VG染色和免疫组织化学染色,进行组织学动态观察和评价,并以Western Blot检测在蛋白水平上证实;取重建术后1周、12周阴道组织行透射电镜观察超微结构的变化。 3.正常阴道组织和重建12周之新阴道组织各取4条,剪成环状,每段长1.5~2cm,立即置于4℃左右的Kreb's液中,通以95%的O_2和5%的CO_2的混合,使组织条在麦氏浴槽恒温系统稳定,打开BL—M20F生物信号采集处理系统,加入预测试的药物,及接通电极,然后记录这些药物或电刺激下的收缩曲线,并用系统自带TW-WAVE软件对图像进行相应分析。 4.选取我院2006年4月至2007年9月间因“先天性无阴道”入院的6例患者实施应用组织工程医用生物补片法的人工阴道成形术进行临床观察,记录围手术期和术后随访情况,对新阴道的形态、长度和弹性进行评估,术后有性生活的患者进行性生活质量调查问卷。 结果 1.手术建模过程中,发现雌性小型实验猪的生殖器官解剖特点为子宫呈双角,体小而角长;宫颈长而宫体小;子宫血运多来自卵巢血管,血管网集中于子宫体及双角;阴道较为宽大,长约12-14cm,宽约3-4cm,且与周围组织如膀胱、直肠间隙较为疏松;尿道外口特殊,尿道外口位于阴道后端与阴道前庭交界处之腹侧壁偏向上方和内侧。手术建模过程顺利,手术切口全部如期愈合,未见感染、血肿、排斥等并发症。预期时间段取材,未见阴道狭窄、补片脱出、阴道塌陷等现象,阴道组织生长良好。 2.组织工程医用生物补片重建阴道1周,大体上看阴道粘膜覆盖近2/3,色泽鲜红,上段约1/3仍可见补片。测量阴道长度约8cm。镜下上皮层数少,仅1-2层结构,平坦;超微结构显示排列疏松,不规则,极向消失,但已可见上皮细胞间有桥粒连接。4周至6周,重建之阴道的内腔继续粘膜上皮化,外观渐接近正常阴道。镜下可见粘膜上皮层逐渐增厚,层数增多,达到4~5层,极向恢复,接近正常上皮层结构。12周时,大体上和正常阴道很难区分,阴道长度9cm。光镜下上皮层的结构同正常类似,多层,极向排列,近内腔表面的上皮细胞为扁平状。透射电镜检查,上皮细胞分层分化良好,排列有序,细胞的相邻面有桥粒连接,极性上皮细胞的顶端相邻有紧密连接,缝隙连接。上皮广谱角蛋白单克隆抗体AE1/AE3免疫组织化学染色证实重建的内腔面有上皮组织的存在,且自重建后1周开始即可见,并且其上皮阳性染色的程度与HE染色观察结果一致;Western Blot从蛋白水平上证实了上皮角蛋白的存在,并且随着重建时间的延长,蛋白量有逐渐增多的趋势。 3.VG染色、平滑肌肌动蛋白单克隆抗体α-actin免疫组织化学染色显示,重建阴道后4周,开始出现散在、分布不规则的平滑肌肌细胞,此后随着时间的延长,渐形成排列均匀的肌束;Western Blot通过对α-actin的蛋白水平的检测发现,2周时有可疑平滑肌痕迹,4周时有较为明确的表达。 4.VG染色和透射电镜的观察发现重建阴道1周,胶原纤维排列较疏松,超微结构观察显示上皮下可见成纤维细胞长入基质中;成纤维细胞中线粒体增多,核内染色质浓集,质内有丰富的池样扩张的粗面内质网;重建后12周时,胶原纤维排列较致密,可见弹性纤维;电镜下可见成纤维细胞不活跃,呈静止状态,周围分布着大量胶原纤维,排列整齐。 5.组织浴槽实验结果发现,重建阴道12周后与正常阴道组织类似,对药物KCL刺激均能产生收缩波,反应强度变化二者之间没有统计学差异。但对于去甲肾上腺素、乙酰胆碱等药物刺激重建之新阴道没有产生收缩活动;在电刺激中,重建之新阴道与正常阴道组织均在不同电压、不同频率的电刺激下产生不同的刺激反应,二者反应的强度变化类似。 6.临床观察我院6例行组织工程医用生物补片法人工阴道成形术的患者,围手术期恢复良好,未见手术并发症。术后4~6周阴道粘膜已基本完全上皮化。术后12周,新阴道大约长9cm,粘膜光滑红润,富有弹性。术后随诊6月时,没有狭窄、异味分泌物、阴道干燥感。其中2例术后4个月时有正常性生活,术后8~11月时性生活质量评分较高,提示性生活较满意。 结论 1.首次在实验动物小型猪上构建组织工程医用生物补片重建阴道的模型,并进行重建之新阴道的组织学、功能学的效果评价。手术探明了雌性小型猪生殖道的解剖结构,以及和周围组织的毗邻关系,为日后盆底重建动物模型打下良好的理论和实践基础。新阴道状态稳定,结果可靠,组织工程医用生物补片重建小型猪阴道模型成功。 2.利用组织工程医用生物补片重建阴道的长度令人满意,未见阴道狭窄、排斥、坏死和挛缩等现象,通过组织学方法证实了组织工程医用生物补片重建猪之阴道模型中,有阴道上皮、肌纤维组织的再生(α-actin阳性)。重建12周的新阴道和正常阴道的组织结构相近。 3.利用组织工程医用生物补片在小型实验猪重建12周的新阴道,通过组织浴槽实验进行功能检测,结果发现对药物KCL和电刺激有着和正常阴道组织相似的反应,从而说明新阴道具有完整的粘膜结构,以及同正常阴道组织相近的平滑肌功能。 4.组织工程医用生物补片在临床“人工阴道成形术”效果良好,阴道壁富有弹性和润滑,未见狭窄、异味分泌物。组织工程医用生物补片具有阴道重建的理想材料的潜能,但因目前应用例数有限,临床观察时间较短,其疗效尚需进一步观察。


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