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染色质重塑复合物亚基hSNF5结合蛋白hNOP17的鉴定及功能初步研究

邸玉玮  
【摘要】: 染色质的形成经过多层次包装,同时具有动态结构,使其既能以适合真核细胞核大小的包装形式存在,又能作为模板进行转录、复制、损伤修复。在这种动态结构中起重要作用的酶包括染色质重塑和修饰酶。ATP依赖性染色质重塑复合物是重要的染色质重塑酶,包括四个亚家族:SWI2/SNF2、Mi-2/CHD、ISWI、INO80/SWR1。SWI2/SNF2是最早在酵母中发现的ATP依赖性染色质重塑复合物。人类具有同源的SWI/SNF复合物,具有转录激活和转录抑制的双重作用,具体功能根据所调节的基因及复合物的组成的不同而不同。SWI/SNF复合物通过与不同蛋白因子相互作用,是整合多种传导到细胞核的酶的级联信号通路的理想平台。人类SWI/SNF复合物中高度保守的亚基除了ATP酶亚基BRG1/BRM外,INI1/SNF5是基本亚基之一,存在于所有SWI/SNF复合物中。INI1/SNF5的功能包括通过蛋白的相互作用,募集SWI/SNF复合物到基因的启动子区调节转录。INI1/SNF5具有调节细胞周期进程及肿瘤抑制功能,目前研究较多的是其在p53/p21CIP/WAF1及p16INK4a/cyclinD/Rb/E2F通路中的作用。我们的早期研究是以hSNF5为诱饵,通过酵母双杂系统,在人胎脑cDNA文库中筛选得到五个可能的hSNF5结合蛋白。在此,我们对其中一个蛋白hNOP17与hSNF5的结合进行了验证,并对其功能进行了初步探讨。所获得的结果为INI1/SNF5的功能及转录调节机制的研究提供了新的线索: 1.通过PCR,在人胎脑cDNA文库中得到hNOP17全长cDNA片段。构建原核表达质粒,在大肠杆菌内表达GST-hNOP17融合蛋白并亲和纯化。通GST-pull dowm证明GST-hNOP17能够与真核细胞全抽提物中的hSNF5共沉淀,提示在体外实验中hNOP17能与hSNF5结合。 2.构建hNOP17真核细胞表达质粒,并在293T细胞内表达。在293T细胞内共同过表达FLAG-hNOP17及Myc-hSNF5,用标签抗体进行免疫共沉淀实验,证明FLAG-hNOP17能与Myc-hSNF5共沉淀,提供了hNOP17与hSNF5结合的体内实验证据。 3.根据氨基酸残基序列,预测hNOP17蛋白功能结构域及结构域连接区并据此构建了hNOP17的不同删切片段的真核表达质粒,在293T细胞内与hSNF5共同过表达,免疫共沉淀实验发现hNOP17 C末端的亮氨酸拉链结构及N末端的1-56个氨基酸残基是hNOP17与hSNF5结合的重要区域。对hSNF5 C末端进行删切,构建真核表达质粒并进行免疫共沉淀实验,发现hSNF5 C末端是与hNOP17结合的重要区域,具体结合区域有待进一步实验。 4.鉴于hNOP17是一种功能未知的蛋白,因此,以~(32)p标记的hNOP17cDNA为探针杂交包括12种组织mRNA的多组织膜,结果发现hNOP17在12种组织内广泛分布,并且在骨骼肌、脑、肾脏、肝脏、胎盘中表达水平较高。 5.在大肠杆菌内表达hNOP17并纯化包涵体,制备hNOP17的兔多克隆抗血清,Western-blot结果显示抗血清检测效果特异。 6.构建红色荧光标签的hNOP17真核表达质粒,与Myc-hSNF5共同在293T细胞中过表达,应用细胞免疫荧光染色技术证明hNOP17与hSNF5在细胞内共定位。用hNOP17的兔多克隆抗血清及Myc抗体免疫荧光染色hNOP17及Myc-hSNF5,结果证明hNOP17与hSNF5共定位于细胞核。用hNOP17的兔多克隆抗血清免疫荧光染色神经源性的SH-SY5Y细胞及骨骼肌源性的RD细胞提示内源性hNOP17主要分布于细胞核。 7.通过双荧光素酶报告基因实验,发现hSNF5对p21CIP/WAF1启动子有转录激活作用,hNOP17对p21启动子有抑制作用并且这种抑制作用可以被hNOP17 RNAi去除。共同表达hSNF5及hNOP17,hNOP17能够抑制hSNF5对p21CIP/WAF1启动子的转录激活作用。提示hNOP17与hSNF5在功能上有重要联系。 作为一种新的hSNF5结合蛋白,hNOP17的研究将为hSNF5及SWI/SNF复合物调节基因转录及其它功能的机制研究提供新的证据。我们将进一步研究hNOP17作用于p21CIP/WAF1启动子的机制。


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