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地黄种质遗传关系及根际土壤微生物多样性研究

祁建军  
【摘要】: 地黄(Rehmannia glutinosa)为玄参科(Scrophulariaceae)多年生草本植物,其膨大的块根可以加工成鲜地黄、生地(黄)和熟地(黄)三种方式入药,是一种大宗常用传统滋补中药。地黄药材全部来源于人工栽培,在长期的人工栽培历史中,形成了众多的栽培品种或者变种。目前文献报道的地黄栽培品种就达50多个,然而只有少数品种的形态和农艺性状有比较详细的描述,多数是品种混杂,遗传关系不清楚。本研究根据地黄的来源、栽培品种、田间变异以及部分种子繁殖材料,建立了地黄种质资源圃。对所有材料从外观性状(叶型、叶色、叶缘、根重、根皮颜色、花冠和花药颜色,及植株形态等)方面作了研究分析;同时,应用RAPD、AFLP及rDNA-ITS等分子标记分析方法,对收集到的地黄种质从遗传物质的变异方面进行了深入研究。结果表明,89份地黄种质样本经过分子标记的遗传相似性聚类、外观形状分析和ITS序列比较,剔除重复后鉴定出二十一类共48份种质。其中种质2、20、39、50、53、71、82、86等既具有特异的基因型,又具有明显的表型性状,是挖掘地黄种质优异基因需要特别关注的新材料,也是根据遗传关系选择杂交育种工作需要考虑的“远缘”亲本。8对AFLP引物扩增出1019条带,10条RAPD引物扩增出了118条带,应用UPGMA和SHAN方法对这两组数据建立了地黄的遗传距离树状图。对根据AFLP-RAPD建立的遗传关系图上差异较大的种质进行了rDNA-ITS序列比较分析,参考GENBANK数据库地黄ITS序列和测定序列,应用Mega3.1软件建立了部分地黄种质进化树。地黄ITS1+5.8S+ITS2序列长度为611~613bp,其中有22个位点存在地黄属植物进化相关的碱基变化信息,C-T颠换是地黄ITS序列变异的主要碱基变化。 另外,生产实践表明,地黄种植生产中存在严重的连作障碍问题。我们推测,地黄连作问题可能和根系对土壤的微生物生态变迁有关。因此,本研究测定了地黄根际土壤和非根际土壤的土壤微生物生物碳(SMBC)、基础呼吸、代谢商和土壤pH值等基本理化数据,同时,采用基于Biolog唯一碳源利用的群落水平生理刨面(CLPP)和磷脂脂肪酸(PLFA)法,研究了地黄根际土壤微生物的群落功能和结构变化。地黄种植地田间调查表明,连作问题不仅在2年生田间发生,5年轮作田也存在。地黄根际土壤SMBC无明显变化,但是基础呼吸和代谢商显著高于非根际土壤;相反,基于Biolog碳源培养分析的地黄根际土壤微生物的AWCD和Shannon指数均有显著的下降,同时,AWCD和SMBC具有随季节变化的相似特征,在地黄生长发育的旺季高,而在收获季节低。应用主成分分析法对不同处理土壤样品在Biolog生态盘上的31种不同的碳源的代谢生理进行分析表明,主成分一(PC1)和主成分二(PC2)能够有效的区分不同处理的土壤,可以反映地黄根际土壤微生物群落的功能变化。主成分共解释了81.47%的变异,其中PC1为67.42%,PC2为14.05%。在所有33种PLFAs中,有18种PLFAs占88-90%的丰度,是地黄根际生态系统的主要成分。所有测试土壤中,真菌PLFA(18:2ω6,9)具有相对较高的丰度,并且发现比较一致的结果,地黄根际土壤真菌比对照土壤高1.36~2.62倍。总之,地黄根际土壤微生物生态研究表明,地黄种植改变了土壤微生物的代谢活动,降低了能量代谢的效率,同时,地黄根际土壤微生物的结构也发生明显的变化,这些变化会引起植物的不良生长,可能是引起地黄连作问题的主要原因。


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