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骨髓基质干细胞体内成骨分化研究

吴江群  
【摘要】: 目的:探讨自体骨髓基质干细胞移植在股骨头缺损坏死部位,移植的骨髓细胞能否成活,能否停留在骨坏死、缺损部位生长增殖,能否分化为成骨细胞,及能否促进成骨、修复股骨头缺损坏死。 方法:试验分三部分。①抽取双侧狗髂骨骨髓。骨髓细胞行贴壁细胞分离法分离骨髓基质干细胞(BMSCs),进行体外培养扩增,试验用第二代细胞。移植前,用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)标记BMSCs。在狗双侧股骨头后外侧软骨面近头颈交界处,用直径8mm的环钻向股骨头中心方向钻孔10mm深度,造成股骨头直径8mm、深度10mm的骨缺损模型。环钻取出的骨质经微波灭活后,与标记的BMSCs复合,植入一侧自体股骨头缺损处,另一侧单纯植入微波灭活骨作为对照,术后5周取材。②抽取双侧髂骨骨髓,行密度梯度离心法分离BMSCs,用荧光染料羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)标记BMSCs,用明胶海绵吸附分离出的BMSCs,植入一侧自体股骨头缺损处,另一侧单纯植入明胶海绵作为对照,术后3周取材。③将体外培养扩增的BMSCs,与脱抗原小牛松质骨复合植入一侧自体股骨头缺损处,另一侧单纯植入脱抗原小牛松质骨作为对照,术后12周取材。利用激光共聚焦显微镜和免疫组织化学法分别观察CFSE和Brdu的标记和体内定位情况。行X射线片,大体组织观察,组织化学染色,图像分析,及通过免疫组织化学方法和荧光免疫组织化学方法检测成骨细胞特异性分化标记核心结合因子a1(Cbfa1)、骨钙素、骨桥素和Ⅰ型胶原,以了解BMSCs体内分化状况和成骨效果。 结果:大体组织学观察显示,BMSCs移植侧骨缺损成骨程度明显强于对照侧。显微组织学研究的结果进一步显示,BMSCs移植侧骨缺损区内的成骨量、骨基质矿化的程度、骨成熟度明显高于对照侧,含有更加丰富的梭形间充质细胞和成骨细胞,成骨细胞分化特异性标记Cbfa1、骨钙素、骨桥素、Ⅰ型胶原表达也明显强于对照侧。股骨头缺损内发现大量BrdU阳性细胞,新骨形成越活跃的地方,BrdU阳性细胞数目越多,很多成骨细胞BrdU阳性,新骨形成区的很多血管壁也分布着BrdU阳性细胞。荧光显微镜下观察,见BMSCs移植侧带有CFSE绿色荧光的细胞定位于骨缺损内,与抗RunX2、Osteocalcin、Osteopontin一抗反应的二抗(带罗丹明标记)在绿色荧光集中的地方也集中发出红色荧光。 结论:移植的骨髓细胞在股骨头内能成活,并能停留在骨缺损部位生长增殖。移植的BMSCs能分化成为多种细胞,包括成骨细胞、软骨细胞及血管壁细胞等。BMSCs能分化成成骨细胞参与成骨,也能参与血管形成。移植的BMSCs能显著促进骨坏死和骨缺损的修复。


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