重组EpoAB-NGF模拟肽表达及纯化的初步研究

【摘要】： 促红细胞生成素(Epo)作为促进红细胞生成、改善造血的生长因子已经在临床上广泛应用于治疗多种原因所致的贫血症。新近发现其在神经血管等系统中还具有不依赖于促红作用的细胞营养保护功能。而且,此种营养保护作用已经被定位到了其序列中一个由17个氨基酸组成的多肽顺序上,称作Epo-AB肽(AEHCSLNENITVPDTKV)。研究表明,Epo-AB肽在行使神经营养保护作用的同时可免除红细胞增生的副作用,再加上可通透血脑屏障的特点,有很好的应用前景。 神经生长因子家族成员(NGF BDNF,NT-3,NT-4/5等)可通过结合靶细胞膜上的高/低亲和力受体(Trk/p75NTR)调控神经元的存活、增殖、分化、突触生长和凋亡等生命过程,有较好的临床应用前景。但是神经生长因子等分子量较大,很难通过血脑屏障到达脑部行使功能。本课题组已经构建了表达p75NTR的R2L1凋亡细胞模型,利用该细胞模型和噬菌体展示文库筛选出了有抗凋亡作用的p75NTR的模拟配基即NGF的模拟多肽(环9肽及12肽)。模拟多肽由于分子量小而有希望与有关其他蛋白融合后,通透血脑屏障到达中枢神经系统行使功能。 本课题旨在构建融合基因,表达单纯的Epo-AB肽和Epo-AB肽-NGF模拟肽融合蛋白,探索表达纯化的条件,为进一步研究表达产物的生物化学性质打下基础。 首先,利用DNA的化学合成法合成有关基因片段,结合重叠PCR的方法,获得了含有EcoRI-α-factor-EGF-凝血酶位点-EpoAB-连接肽-EcoRI融合基因的DNA片段,克隆至pUC-18质粒载体中。再以该质粒载体为模版,通过PCR扩增将NGF模拟肽的DNA序列(编码9或12个氨基酸)插入至上述融合基因的连接肽后面,再将该片段克隆至pUC-18载体中。然后,构建酵母分泌型表达载体。即将融合基因用EcoRI酶切回收后克隆至pAO815的EcoRI位点,再利用同尾酶BglⅡ和BamHI构建了含有6个串联拷贝的酵母表达载体(分别命名为pAO-6E-EpoAB-9和pAO-6E-EpoAB-12)。进而,利用毕赤酵母表达体系完成了重组蛋白的表达。而后经过疏水柱层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析三步纯化后,得到了纯度较高的蛋白产物。最后,利用蛋白免疫印迹杂交、蛋白质谱分子量测定、MS-肽图结合生物信息学分析对纯化蛋白进行了初步的鉴定。