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骨髓来源Flk-1~+CD34~-间充质干细胞治疗大鼠脑出血的实验研究

柳夫义  
【摘要】: 研究背景和目的 脑卒中包括脑梗死和脑出血,目前是致死和致残的最主要原因之一。对于神经组织损伤导致的功能障碍目前尚没有有效的治疗方法。 近来干细胞的研究的进展给脑卒中的治疗带来曙光,多种来源的干细胞或前体细胞被用来治疗脑卒中的研究,包括胚胎干细胞(ES)诱导分化而来的神经前体细胞、胚胎或者成体脑组织来源的NSCs以及各种来源的间充质干细胞(MSCs)。其中MSCs作为一种成体干细胞,因为不涉及伦理问题,非常具有应用前景。干细胞治疗的目标最初是设想通过干细胞移植来替代修复损伤的神经组织,但大量的实验研究一直没有提供可靠的证据。近来的一些研究则显示外源性细胞可能作为一种营养支持机制,促进内源性神经、血管以及突触连接的再生从而发挥作用;最近的研究则显示减少神经元的死亡、减轻炎症反应、减轻瘢痕形成和促进白质的功能再塑可能是更重要的机制。 近年来逐渐出现了一些利用干细胞治疗脑卒中的临床Ⅰ期实验,其中最受关注的是MSCs,本课题组也在进行MSCs的临床前期实验。但MSCs用于临床还面临许多问题:1、具体的治疗机制目前还不明了;2、细胞移植的时间、移植途径、移植细胞的数量尚需实验比较选择和确定;3、MSCs虽然可以自体移植,但临床上常常会遇到一些需要异基因移植的紧急情况;脑卒中患者多数是老年患者,其从其自体骨髓分离MSCs效率低,结合MSCs免疫原性低的特点同种异基因移植似乎更具有优势;实验研究以及临床前的安全性评估均需要使用MSCs进行异种移植,但移植免疫排斥的问题一直没有系统的研究。 本课题研究目的一是探索MSCs治疗大鼠脑出血模型中最低的有效剂量,以便为灵长类动物实验及临床实验确定移植细胞数量提供参考依据;二是探索MScs可能的治疗机制;三是探讨MSCs的免疫原性,异种移植中的免疫排斥问题以及多次移植的可行性及有效性。研究内容和方法 本课题研究分为两大部分。第一部分:探索MSCs治疗大鼠脑出血模型的有效性和最低有效剂量;分为3个剂量组和一个对照组即A:2×10~5/15ul/只(即1×10~6/kg)、B:4×10~4/15ul/只(即2×10~5/kg)、C:8×10~3/15ul/只(即4×10~4/kg)、D:空白对照;同时探讨其治疗机制;第二部分:以人外周血单个核细胞作为对照,研究MSCs间隔2周两次脑内移植后细胞存活情况、局部免疫排斥、动物行为改善情况,以MSCs作为刺激细胞与大鼠外周淋巴细胞进行混合淋巴细胞培养观察MSCs的免疫原性和免疫调节作用。 研究结果 1、2×10~5/15ul/只(即1×10~6/kg)剂量组可以明显改善大鼠的功能评分;4×10~4/15ul/只(即2×10~5/kg)剂量组仅在3天和1周时行为学评为有统计差异,其他观察点未见改善;低剂量组未见行为学改善; 2、MSCs移植后并不改变血肿的大小,但可以明显减轻血肿周围的炎症反应(治疗组ED1+和MPO+细胞减少);RT-PCR测定发现IL1β、IL2和TNF-α含量较对照组明显减少; 3、治疗组病灶周围细胞凋亡明显减少,Niss1染色神经元计数较对照组多,Niss1小体消失较对照组少; 4、MSCs移植后主要集中在血肿周围,MSCs集中的区域新生血管明显增多;部分移植细胞沿血管壁排列,可疑向内皮分化; 5、MSCs异种移植未见诱导明显的特异性免疫排斥反应,第二次移植后细胞存活情况通初次移植没有差异,局部炎症反应也没有明显差异;对照组(人外周单核细胞)第二次移植后局部则发生明显炎症反应; 6、两次移植MSCs组动物行为学改善较急性期一次移植效果好;本部分实验同时观察到造模后2周移植MSCs仍然可改善动物行为评分,但疗效较急性期移植差;慢性期移植后细胞存活的数量较急性期多; 7、混合淋巴细胞培养提示MSCs本身并不能刺激大鼠外周血淋巴细胞增殖,而且可抑制ConA刺激的大鼠淋巴细胞增殖; 结论 2×10~5/15ul/只(即1×10~6/kg)剂量可以有效改善大鼠行为功能,最低的有效剂量可介于4×10~4/15ul/只(即2×10~5/kg)二者之间;MSCs治疗机制包括减轻出血后的炎症反应,减少神经元凋亡,促进血管再生。MSCs异种移植未见明显的免疫排斥,不诱导机体产牛特异件免疫应答,多次移植可以改善功能恢复。


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