移植物抗宿主病的预后分析及前列腺素E_2对CD4+T细胞的免疫调节作用的研究

【摘要】： 第一部分同胞相合供者干细胞移植后移植物抗宿主病的预后分析 【研究背景】 对于血液系统肿瘤性疾病,异基因造血干细胞移植(allo-SCT)是一个广泛应用的治疗手段,这明显改善了部分疾病的预后,随着移植技术的进步,越来越多的病人获得了长期生存。但allo-SCT具有较高的移植物抗宿主病(GVHD)发生率,这是造成移植病例非复发死亡的主要原因和影响长期存活病例生活质量的主要并发症。另一方面,GVHD与移植物抗白血病作用(GVL)密切相关,对于基础疾病的复发具有保护作用。因此,平衡GVHD与GVL是改善allo-SCT预后的关键,也是控制GVHD的核心问题。 【目的和方法】 评价急性和慢性GVHD对于allo-SCT预后的影响,即对于总体死亡率(allcause mortality,ACM)、治疗相关死亡率(TRM)、原发疾病复发率和总体生存率(OS)、无病生存率(DFS)的影响,以研究控制GVHD的最佳策略。为此我们分析了一个均质性较好的病例群体,即在急性淋巴细胞白血病(ALL)及急性髓系白血病(AML)第一完全缓解期、慢性粒细胞白血病(CML)第一次慢性期接受同胞相合供者移植的病例,所有病例均来自医科院血研所。主要的观察终点包括任何原因引起的死亡和原发疾病的复发。 【结果】 1.从2000年1月至2007年12月,共计171符合标准的病例,中位随访时间730天(23～2500天)。随访期末,105例病例存活,其中97例持续完全缓解(CCR),总体生存率(OS)和无病生存率(DFS)分别为53.6%和50.8%;共计66例死亡病例,ACM46.4%,其中47例为治疗相关死亡(TRM),而19例为复发相关死亡,累积发生率分别为30.7%和15.8%。随访期末,27例复发病例中6例带病生存,2例再次缓解。 2.发生Ⅱ～Ⅳ度急性GVHD的病例TRM较高、总体预后较差。即无急性GVHD组(n=73)、Ⅰ度急性GVHD组(n=74)和Ⅱ～Ⅳ度急性GVHD组(n=24),3年DFS分别为59.7%、62.6%和25.0%(p＜0.0001),三组间TRM分别为21.4%、28.3%和63.5%(p=0.0002),三组间疾病复发率无明显差异。 3.发生广泛型慢性GVHD的病例TRM较高、复发率较低,总体预后较差。即无慢性GVHD组(n=78)、局限型慢性GVHD组(n=47)和广泛型慢性GVHD组(n=34),3年DFS分别为67.0%、70.7%和36.9%(p＜0.0001);三组间TRM发生率分别为12.9%、23.3%和66.3%(p＜0.0001),三组间疾病复发率分别为24.9%、17.7%和2.9%(p=0.06)。 4.并发Ⅱ～Ⅳ度急性GVHD的病例及发生广泛型慢性GVHD的病例中,应用皮质激素累积剂量≥14mg/kg的病例预后较差(3年DFS:14.5%vs 47.0%)。 5.对不同病种的分析表明:在ALL病例,与无急性GVHD的病例相比,发生轻度急性GVHD的病例具有较高的3年DFS(64.2%vs 14.7%,p=0.002)和较低的疾病复发率(13.9%vs 42.6%,p=0.04);在CML病例,任何级别的急性GVHD均与较差的预后相关,即在无急性GVHD、并发Ⅰ度急性GVHD和并发Ⅱ～Ⅳ度GVHD的病例,3年OS分别为86.0%、63.3%和36.4%(p=0.0004),3年DFS分别为82.9%、62.7%和36.4%(p=0.0007),而相对于无慢性GVHD及并发广泛型慢性GVHD的病例,发生局限型慢性GVHD的病例具有生存优势:3年OS分别为80.4%、26.5%和100%(p＜0.0001)。 6.对allo-SCT预后相关因素的多因素分析表明:基础疾病类型(ALL vs AML vs CML:p＜0.0001,RR=0.533,95%CI:0.393～0.723)、发生严重GVHD(Ⅱ～Ⅳ度急性GVHD以及广泛型慢性GVHD vs对照:p=0.001,RR=1.93,95%CI:1.17～3.17)和应用大剂量皮质激素(p＜0.0001,RR=2.43,95%CI:1.42～4.15)是独立的预后因素。 【结论】 1.TRM是allo-SCT病例主要的死亡原因。 2.对于ALL病例,发生Ⅰ度急性GVHD对预后具有保护作用,可以降低疾病复发率而不增加TRM; 3.对于CML病例,局限型慢性GVHD是预后的保护性因素;而任何级别的急性GVHD均是预后不良的危险因素; 4.无论何种疾病,Ⅱ～Ⅳ度急性GVHD及广泛型慢性GVHD均是预后不良因素,明显增加TRM,而对于疾病复发无保护作用;发生严重GVHD后,应用大剂量皮质激素并不能改善预后。 5.多因素分析发现,基础疾病类型、严重GVHD(Ⅱ～Ⅳ度急性GVHD和广泛型慢性GVHD vs对照)和应用大剂量皮质激素是预后不良的独立危险因素。 【研究背景】 前列腺素E_2(PGE_2)在体内自身稳定、炎症以及抗炎反应等生理过程中发挥重要的调节作用,特别是具有较强的免疫调节作用,与免疫耐受、自身免疫病、移植免疫以及肿瘤免疫的关系十分密切。在急性移植物抗宿主病(GVHD)的发生、发展过程中,T细胞是主要的效应细胞,其免疫活性与GVHD的发生率和严重程度具有明显的相关性。研究结果表明,PGE_2可以通过诱导CD4+CD25+Foxp3+的调节T细胞,通过抑制T细胞激活或直接抑制T细胞的增殖而调节T细胞介导的免疫反应,这对于急性GVHD的调控具有重要意义。 【研究目的】 研究体外培养条件下PGE_2对人外周血CD4+T细胞的免疫调节作用,通过表达谱基因芯片检测发现新的靶基因,通过ELISA、流式细胞术以及免疫印记等方法检测下游产物,进一步阐明PGE_2调节CD4+细胞免疫功能的作用机理。 【材料和方法】 1.分离健康志愿者捐献的白膜,应用密度梯度离心法分离单个核细胞,应用CD4+单克隆抗体标记的免疫磁珠分离纯化CD4+T细胞。 2.在13umol/L浓度的PGE_2条件下,应用抗CD3和抗CD28单克隆抗体作为刺激剂,将纯化的CD4+T细胞体外培养12h。收集细胞后提取RNA,进行表达谱基因芯片检测,并应用RT-PCR检测对芯片结果进行验证。 3.分析芯片结果,发现有意义的基因,应用ELISA、流式细胞术及免疫印记等方法检测目的基因的表达产物。 【结果】 1.流式细胞术检测结果显示,应用免疫磁珠分选的CD4+T细胞纯度≥99%。表达谱基因芯片结果表明,与对照组相比,应用13umol/L浓度的PGE_2作用12小时后,CD4+T细胞基因表达以下调为主,即以倍数变化1.5倍为准,表达上调的基因有73个,表达下调的基因有1716个,涉及的信号途径主要有肿瘤坏死因子α(TNF-α)与核因子-kB(NF-kB)信号途径、T细胞受体信号途径、白细胞介素2(IL-2)信号途径、MAPK信号途径等。 第二部分体外培养中前列腺素E_2对CD4+T淋巴细胞的免疫调节作用 2.ELISA法检测培养上清的细胞因子浓度,结果表明实验组与对照组相比,干扰素γ(IFN-γ)与TNF-α浓度明显下降。在培养后24、48、72小时等时间点,实验组IFN-γ浓度分别为0、(2.3±4.7)pg/ml、(10.9±4.7)pg/ml,对照组分别为(399.6±332.1)pg/ml、(842.8±479.7)pg/ml、(2963.1±644.9)pg/ml,差异均具有统计学意义。在培养后48小时和72小时,实验组TNF-α浓度分别为(113.5±57.3)pg/ml、(189.7±32.0)pg/ml,对照组分别为(1093.7±353.3)pg/ml、(1627.2±498.6)pg/ml,差异均具有统计学意义。但对照组与实验组在各个时间点的IL-2浓度均低于试剂盒检测阈值。 3.流式细胞术检测结果表明实验组和对照组比较,CD4+T细胞CD25、CD69、HLA-DR、CD40等表面抗原表达率下降。 【结论】 1.在体外培养条件下,PGE_2对CD4+T细胞的基因表达具有明显调节作用,并且以负性调节为主,表达有差异的基因以免疫相关的细胞信号途径为主。 2.PGE_2作用于CD4+T细胞,明显下调介导GVHD的细胞因子的分泌,并下调与CD4+T细胞免疫激活和辅助刺激相关的表面分子。 3.总之,体外实验表明,PGE_2抑制CD4+T细胞的免疫活性,对于急性GVHD的免疫调节具有一定的应用前景。