收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

人VEGF_(165)转基因组织工程软骨的实验研究

王艳梅  
【摘要】: 研究背景:外伤或先天性小耳畸形致耳廓缺损患者在整形外科十分常见,而耳廓软骨几乎无再生修复能力,目前临床上主要的治疗方法为全耳廓再造术,对手术医师技术要求较高,且存在不同程度的并发症,如采集自体肋软骨雕刻耳支架可致胸廓畸形,而支架可能感染、吸收、变形。人工高分子耳支架植入容易引发机体排异反应致使支架外露发生率较高。因此,自体软骨细胞组织工程研究应运而生。尽管已有自体软骨细胞组织工程软骨批准进入临床使用,但仅能修复体积小于1ml缺损。 研究发现组织工程软骨厚度超过1mm,中心易发生“空心”现象。而这种“空心”现象的主要原因在于软骨组织缺乏血管,细胞代谢依赖细胞外基质(extracellular mattix,ECM)的渗透,随着外层细胞外基质不断的合成与成熟,超过一定厚度的内层细胞因传导效率降低,发生代谢障碍致组织缺氧和坏死。因此,保持内层细胞增殖、存活,并维持软骨细胞生物特性成为我们实验研究的焦点。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),是体内重要的促血管生长因子。对成熟软骨细胞分泌表达蛋白的研究发现,软骨细胞表达一定水平的VEGF以提高软骨细胞有丝分裂活性并促进其再分化,在软骨发生发育过程中,对软骨细胞的存活与增殖起着重要的作用。运用基因工程技术,将VEGF基因导入软骨细胞,构建VEGF强化组织工程软骨,将有利于软骨细胞存活、增殖、分化,改善组织工程软骨内部结构。 目的:观察检测残耳软骨细胞体外扩增生物学性能。构建hVEGF_(165)基因载体并转染体外培养的残耳软骨细胞,通过检测转染后软骨细胞VEGF及主要软骨ECM蛋白表达,以分析转VEGF基因软骨细胞的生物性能,并对转VEGF基因软骨细胞体内构建的软骨形态结构、ECM蛋白及相关基因表达进行检测分析。 方法:1.构建重组腺相关病毒rAAV2-hVEGF_(165)-CMV-EGFP载体。2.分离、培养人残耳软骨细胞,检测倍增时间,免疫组化,RT-PCR方法检测其产生软骨ECM主要成分能力,包括蛋白聚糖(aggrecan,AG),Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ,COLⅠ),Ⅱ型胶原(collagen typeⅡ,COLⅡ),Ⅹ型胶原(collagen typeⅩ,COLⅩ)。3.rAAV2-hVEGF_(165)-CMV-EGFP转染软骨细胞,流式细胞技术检测转染效率,组织学染色、免疫组化、Real-time PCR、Western Blot、ELISA检测VEGF表达规律及转染后软骨细胞分泌软骨基质的变化。4.转染rAAV2-hVEGF_(165)-CMV-EGFP的软骨细胞与Pluronic F-127混合,形成细胞材料复合物接种于裸鼠皮下,同时分别设立转染rAAV2-EGFP细胞组及单纯软骨细胞组为对照组,10周后取材,组织学染色、免疫组化比较观察三组软骨组织结构,Real-time POR、Western Blot等方法检测其ECM蛋白及与软骨细胞增殖存活相关基因表达。 结果:1.成功构建rAAV2-hVEGF_(165)-CMV-EGFP载体。2.残耳软骨细胞在体外扩增过程中,逐渐由多角形变为长梭形,AG、COLⅡ、COLⅩ逐渐减少,第5代时COLⅡ、COLⅩ表达消失,并开始表达COLⅠ。3.rAAV2-hVEGF_(165)-CMV-EGFP载体体外成功转染软骨细胞,转染第3天转染效率达20.1±0.62%,并维持稳定。转染后VEGF表达延迟期为14-21天,随VEGF表达增高,软骨细胞AG、COLⅡ、COLⅩ及COLⅠ表达显著增高。4.三组细胞-材料复合物接种裸鼠皮下10周后取材,均形成大小不一的软骨,组织切片染色见VEGF转染细胞实验组形成均一软骨组织,软骨细胞及软骨陷窝分布均匀,糖胺多糖及胶原纤维含量丰富,弹性纤维呈网状分布均匀,而两个对照组软骨组织间见局部空泡样结构,糖胺多糖、胶原纤维含量欠佳,弹性纤维成条索样分割包绕软骨细胞。免疫组化结果见三组样本均有VEGF阳性细胞,实验组分布于软骨组织边缘,对照组散在于组织中,三组Ⅷ因子表达均为阴性。Western Blot结果见实验组VEGF、COLⅡ表达强于对照组,VEGFR-2仅在实验组表达。GAG含量检测实验组显著增高,对照组间无明显差异。Real-time PCR结果显示,实验组较对照组的RunX2、Sox9表达增高,PTH/PTHrR无显著性变化,同时COLX及COLⅡ表达增高,而对照组间RunX2等的表达无明显差异。 结论:1.rAAV2-hVEGF_(165)-CMV-EGFP能体外转染人残耳软骨细胞,转染第3天转染效率达20.1±0.62%,并维持稳定。2.转染后,VEGF表达提高了软骨细胞功能而具备良好的生物学特性。转染14天的第3代软骨细胞ECM主要蛋白表达增高,细胞功能活跃,适宜做为组织工程软骨种子细胞。3.转VEGF基因软骨细胞作为组织工程的种子细胞与pluronic F-127复合后可于裸鼠体内形成转基因组织工程软骨,与对照组相比,转VEGF基因组织工程软骨具良好的生物学特性,结构均一且与正常软骨组织相似,软骨ECM的GAG、COLⅡ、COLⅩ增多,RunX2、Sox9表达增高,细胞处于增生期的肥大状态,初步分析其原因可能是转染后外源性的VEGF持续表达触发了软骨细胞VEGF自分泌,并通过VEGFR-2作用于软骨细胞,提高了软骨细胞活性,促进其存活与增殖,但未在软骨组织内引起血管内皮细胞的迁移及小血管形成。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 边虹;;基因工程的福祉与伦理之思[J];黑龙江教育学院学报;2011年07期
2 孙毅;;生物技术与人类的生产生活[J];科技情报开发与经济;2011年22期
3 王岩;;浅论现代生物技术在发酵食品生产中的应用[J];中国西部科技;2011年23期
4 逍遥;;寻找操纵基因的剪刀[J];生命世界;2006年11期
5 郑晓冬;李宝珠;彭超;高炳淼;朱晓鹏;陈心;长孙东亭;罗素兰;;PCR技术在海洋生物多肽毒素研究中的应用[J];生物技术通报;2011年07期
6 温爽;刘媛;王家伟;谢雅晶;刘贤进;梁建生;;抗伊维菌素scFv蛋白质的变复性及纯化[J];江苏农业学报;2011年03期
7 吴永彬;肖维威;马文丽;;实时荧光定量PCR技术在转基因食品检测领域中的应用[J];生物技术通讯;2011年04期
8 黄曼;刘倩倩;;微生物在采矿及石油开采中的应用[J];科技资讯;2011年22期
9 刘萌;战利;马红霞;高云航;;纤维素酶及纤维素酶基因工程学研究进展[J];安徽农业科学;2011年16期
10 孙毅;;现代生物技术的应用研究[J];科技情报开发与经济;2011年26期
11 丁淑琴;王强;王淑静;王洁;张焱;;结核分枝杆菌rps12基因的克隆及核酸序列的分析[J];宁夏医科大学学报;2011年08期
12 ;奥地利研发出真菌降解塑料方法[J];中国食品学报;2011年05期
13 ;[J];;年期
14 ;[J];;年期
15 ;[J];;年期
16 ;[J];;年期
17 ;[J];;年期
18 ;[J];;年期
19 ;[J];;年期
20 ;[J];;年期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 赵忠芳;吕仁荣;霍然;傅洪滨;徐广琪;;普萘洛尔治疗增生期血管瘤患儿血清中VEGF、MMP-9的变化[A];中华医学会整形外科学分会第十一次全国会议、中国人民解放军整形外科学专业委员会学术交流会、中国中西医结合学会医学美容专业委员会全国会议论文集[C];2011年
2 徐勇;黄仁魏;王东宁;林桂真;林东军;何易;李旭东;林曲;;急性白血病血管内皮生长因子(VEGF)和受体的表达及其临床意义研究[A];中华医学会第八次全国血液学学术会议论文汇编[C];2004年
3 李飞;李树清;;VEGF表达在局灶性脑缺血后亚低温脑保护中的作用研究[A];中国病理生理学会第九届全国代表大会及学术会议论文摘要[C];2010年
4 赵忠芳;吕仁荣;霍然;傅洪滨;徐广琪;;普萘洛尔治疗增生期血管瘤患儿血清中VEGF、MMP-9的变化[A];中华医学会整形外科学分会第十一次全国会议、中国人民解放军整形外科学专业委员会学术交流会、中国中西医结合学会医学美容专业委员会全国会议论文集[C];2011年
5 杜娟;王景美;钱晓萍;刘宝瑞;;COX-2和VEGF在胃癌中的表达和意义[A];中华医学会肿瘤学分会第七届全国中青年肿瘤学术会议——中华医学会肿瘤学分会“中华肿瘤 明日之星”大型评选活动暨中青年委员全国遴选论文汇编[C];2011年
6 田翀;彭晓琳;张嫦慧;唐玉涵;任玮叶;孙秀发;郝丽萍;应晨江;;VEGF在白藜芦醇缓解内皮细胞高通透性的作用[A];营养与慢性病——中国营养学会第七届理事会青年工作委员会第一次学术交流会议论文集[C];2010年
7 陈西华;;小鼠月经模型中Hif-1α对VEGF调节作用的研究[A];中国生理学会第23届全国会员代表大会暨生理学学术大会论文摘要文集[C];2010年
8 梁国刚;;TGF-β1和VEGF在大肠癌中的表达及临床意义[A];第八届全国中西医结合普通外科临床与基础学术会议暨全国中西医结合外科危重病学习班论文汇编[C];2003年
9 廖圣恺;;5-LOX、CD-34、VEGF在涎腺黏液表皮样癌中的表达及意义[A];第八次全国口腔颌面—头颈肿瘤会议论文汇编[C];2009年
10 孙大军;杜建时;王征;臧广生;刘卓;;丹参与VEGF联合应用在动物肢体缺血模型中的实验研究[A];中国中西医结合学会周围血管疾病专业委员会第六届换届暨学术交流会论文集[C];2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王艳梅;人VEGF_(165)转基因组织工程软骨的实验研究[D];中国协和医科大学;2009年
2 张国鹏;两种核素报告基因系统用于监测治疗基因VEGF165表达的基础研究[D];华中科技大学;2010年
3 王钦文;干扰CXCR4对前列腺癌细胞VEGF和MMP-9表达及转移的影响实验研究[D];第三军医大学;2011年
4 费嘉;VEGF mRNA反义核酸对白血病细胞药物敏感性的影响[D];暨南大学;2003年
5 周磊;血管生长因子VEGF_(165)、Angiopoietin-1对心肌保护作用研究[D];南京医科大学;2003年
6 赵薇;细胞因子GM-CSF、VEGF对大鼠内皮祖细胞功能活性的影响及其信号转导途径的体外研究[D];中国医科大学;2008年
7 董宏伟;大肠癌形成过程中肿瘤血管生成与细胞凋亡的变化及VEGF和p53表达的意义[D];中国医科大学;2002年
8 彭湃;VEGF在慢性创面愈合中的作用及机理研究[D];第一军医大学;2004年
9 张颖娟;VEGF抑制TGF-β1诱导肾小管上皮—间充质转化作用中Notch信号系统的变化[D];北京协和医学院;2009年
10 范海涛;Survivin与VEGF的检测及二者反义寡核苷酸对膀胱癌的治疗研究[D];吉林大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 孙洁;VEGF表达及微血管密度与三阴性乳腺癌及非三阴性乳腺癌临床病理特征的关系[D];广西医科大学;2010年
2 齐振平;非小细胞肺癌中VEGF及其受体Flt-1的表达及临床意义[D];大连医科大学;2010年
3 段瑞华;异黄酮孕期使用对子代小鼠乳腺肿瘤中VEGF表达影响的研究[D];河南科技大学;2010年
4 韩喆;VEGF在他汀类药物干预易损斑块形成的表达[D];河北大学;2010年
5 刘小兵;脑胶质瘤VEGF,bFGF,IGFBP-2在血浆和脑脊液的定量分析及意义[D];河北医科大学;2010年
6 张志学;肺腺癌中血管内皮生长因子及其受体的表达与血管生成及预后的关系[D];青岛大学;2001年
7 李磊;VEGF,MMP-2在胃癌中的表达及其与浸润和转移的关系[D];郑州大学;2002年
8 孙丹;Snail、VEGF、MMP-9在肝细胞肝癌中的表达及临床意义[D];山东大学;2010年
9 栾东风;锌对高糖条件下视网膜müller细胞分泌VEGF的影响[D];吉林大学;2010年
10 郭晓斌;在细胞三维立体培养模型中观察VEGF对H460细胞MMP-2表达的影响[D];兰州大学;2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 何国庆 张灏;基因工程 在酶制剂生产中的应用(上)[N];中国食品报;2009年
2 由香港麦迪信医学出版有限公司供稿;VEGF“陷阱”有效抑制肿瘤[N];医药经济报;2002年
3 张中桥;VEGF对乳腺癌的生长起重要作用[N];中国医药报;2002年
4 新华社;VEGF有望成为预防动脉梗塞新药[N];中国医药报;2005年
5 王婷婷;肿瘤能否“饿死”[N];科技日报;2004年
6 文执 编译;抗癌新靶标 肿瘤内的血管[N];科技日报;2002年
7 王天堂;国产防腐新材料亮相[N];中国化工报;2002年
8 毛晓刚;有机食品:涉足正当时[N];经理日报;2003年
9 可德功;“STAT-3”分子可抑制肝脏合成糖分[N];医药经济报;2004年
10 张建松;我国丙型肝炎疫苗研究获突破[N];中国医药报;2000年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978