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应用基因表达谱芯片筛选盆腔器官脱垂相关基因的实验研究

戴毓欣  
【摘要】: ●研究目的: 1.应用基因表达谱芯片,筛选绝经后POP患者与正常绝经妇女主韧带组织中差异表达的基因 2.分析差异表达基因,探讨POP发生的分子机制 ●材料和方法: 1.在绝经状态、年龄、体重指数、产次等影响POP发生的重要因素匹配的前提下,选取3例POP与3例无POP对照的子宫主韧带组织标本。 2.组织标本行HE染色,Masson's三色染色验证组织来源,并观察主韧带组织形态结构。 3.Trizol法提取总RNA,并对总RNA进行定量、质检。采用RNA扩增标记法合成生物素标记的cRNA,与Human Genome U133 Plus 2.0芯片杂交。 4.用SAM软件筛选|Score(d)|≥2,FC值大于2或小于0.5的差异表达基因。用MAS2.0软件对差异表达基因进行基因功能分类注释(GO)和代谢通路分析(Pathway)。 5.实时荧光定量PCR验证DKK1,SFRP1,FZD5,WNT16,COL1A1的差异表达。 ●实验结果: 1.标本行HE染色、Masson's三色染色观察,证实为子宫主韧带组织。POP组女性子宫主韧带组织中胶原纤维与平滑肌束失去正常的排列,形态紊乱,可见胶原纤维断裂,平滑肌束细碎。 2.提取总RNA经定量和电泳检测,质量满足芯片杂交要求。杂交后芯片的各项检测参数均达到质控要求,子宫主韧带组织与基因表达谱芯片的杂交模型建立成功。 3.筛选出179个在POP组和对照组之间差异表达的基因。其中包括20个功能未知的基因。107个基因在POP组中表达上调,72个基因在POP组中表达下调。差异基因涉及多种功能蛋白和代谢通路。其中Wnt信号转导通路变化最显著。 4.实时荧光定量PCR证实DKK1,SFRP1,FZD5,WNT16,COL1A1在POP组中表达明显升高,与芯片结果一致。 ●结论 1.POP患者子宫主韧带组织中胶原纤维与平滑肌束细碎,排列紊乱。POP中编码Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型胶原α1链蛋白的基因COL1A1、COL3A1、COL5A1的mRNA水平和MMP2的mRNA水平明显升高,提示POP中胶原合成增加,分解亦增强。说明POP中胶原的合成和分解活跃,可能以分解为主,引起韧带支持结构功能的改变,导致POP发病。 2.人类全基因组表达谱芯片是一种有效的高通量筛选POP差异表达基因的研究方法。本实验以|Score(d)|≥2,FC≥2或FC≤0.5为标准筛选出179个在POP组和对照组之间差异表达的基因。其中包括20个功能未知的基因。107个基因在POP组中表达上调,72个基因在POP组中表达下调。 3.POP的病理生理过程复杂,涉及多种功能蛋白和代谢通路。其中Wnt信号转导通路的拮抗剂DKK1、SFRP1介导的神经退行性变可能与POP的发病密切相关。 4.实时定量荧光PCR验证目标基因DKK1,SFRP1,FZD5,WNT16,COL1A1在POP组的表达明显高于对照组,变化趋势与芯片一致,佐证了芯片结果的可信性。


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