恶性疟原虫候选抗原PfMAg-1的免疫保护效果评价

【摘要】： 疟疾是目6前世界上对人类危害最严重三大传染病之一,它是由蚊媒传播的寄生原虫病,主要流行于热带和亚热带地区。全世界每年有5亿人受到疟原虫感染,约三百万人死于恶性疟疾。其中80%是五岁以下的儿童和孕妇。疟原虫是疟疾的病原体,寄生于人体的疟原虫共有4种,而恶性疟原虫是这四种寄生虫中最致命的一种。恶性疟原虫生活周期复杂,包括在按蚊宿主发育和人体宿主发育两个阶段。在人体感染阶段,又分为红前期和红内期,其中红内期是导致临床疾病的阶段,严重的贫血、脑疟等症状会导致感染者死亡。由于恶性疟原虫抗药性的不断出现和蔓延,使恶性疟疾的化学治疗难以奏效;由于气候环境的变化以及杀虫剂的广泛使用,导致虫媒对杀虫剂也易产生抗药性,使得人们对疟疾流行的控制及疟疾感染预防和治疗面临巨大难题。人类通过接种疫苗防治感染性疾病有着悠久的历史,在疟疾的防治过程中,人们希望通过有效的预防接种来防止发病,减轻临床症状。然而由于疟原虫生物学特性复杂,其抗原具有阶段特异性、虫株差异性和高度变异性等特点,因此尽管到目前为止已经发现了不少红内期抗原,但对这些抗原无论单独使用还是联合使用都未能达到满意的免疫保护性。因此寻找新的保护性抗原候选基因仍然是疟疾疫苗发展的重点。 pfmag-1是本室利用单克隆抗体(M26-32)从恶性疟原虫cDNA文库中筛选出的新抗原候选基因。M26-32是本室制备的泛疟原虫特异性单克隆抗体,体外实验证实其可以有效地抑制恶性疟原虫生长。前期工作表明,pfmag-1是一个典型的恶性疟原虫基因,A/T含量高达75.59%,它编码一个全长589氨基酸的蛋白PfMAg-1;预测分子量70.2KDa;PfMAg-1蛋白C末端为14个拷贝的十肽重复结构域,主要的重复单元为QTEIKND(H/N)I。PfMAg-1基因位于恶性疟原虫4号染色体,在基因组上仅有一个拷贝。PfMAg-1蛋白在恶性疟原虫的晚期裂殖体期表达。 PfMAg-1基因在基因组水平有9个外显子和8个内含子,完整的C端重复十肽氨基酸序列由最后一个外显子编码。实验证明该基因在不同来源的恶性疟原虫虫株T996,D10,Dd2,Honduras-1,HB3,FCC1,FCC2,FCR3中均较为保守,N端包括第一个外显子第一个内含子和第二个外显子在序列上基本一致。PfMAg-1C端蛋白在上述8株恶性疟原虫中均存在特征性的十肽重复结构域,只是在重复次数上有所差异,从14-19次不等。pfmag-1序列比对的结果表明,与之同源性最高的几条序列依次来自间日疟原虫(Plasmodium vivax)、伯氏鼠疟原虫(Plasmodium berghei)、约氏鼠疟原虫(Plasmodium yoelii yoelii)和夏氏鼠疟原虫(Plasmodium chabaudi)蛋白。有趣的是,这些序列或者与PfMAg-1非重复区同源,或者与其重复区同源,但没有一个蛋白分子和PfMAg-1完整序列同源。其中约氏鼠疟原虫和PfMAg-1序列C未端重复区同源的蛋白(pypAg-1)(1)免疫小鼠后,可以在约氏疟原虫攻击时提供有效的保护。本文还观察到PfMAg-1在红内期可能经历了酶解过程,释放出非重复区和重复区肽段,提示PfMAg-1蛋白作为仅表达于恶性疟原虫内的蛋白分子,在进化上更接近高等生物,以适应于在人体内寄生的独特需要;其C端十肽单位重复次数的差异提示其受到宿主免疫系统的压力,自然条件下具有一定免疫原性。 本研究旨在围绕对PfMAg-1免疫原性的全面观察,进一步探讨PfMAg-1作为新一代恶性疟疾疫苗的可能性。通过表达全长基因PfMAg-1蛋白,探讨完整PfMAg-1蛋白在免疫保护中的作用以及在疟原虫体内可能发挥的生物学功能。由于在前期实验中,尝试在原核表达系统中表达全长PfMAg-1蛋白未获成功,因此本试验尝试在毕赤酵母表达系统中表达全长PfMAg-1蛋白。将全长pfmag-1基因克隆于分泌性表达载体pPICZαB,并转入酵母GS115进行表达,尽管证实克隆质粒已整合到酵母基因组中,并筛选了Mut+基因型转化子,但始终未能获得重组蛋白的表达。 根据生物信息学软件的分析结果,我们分别克隆并在原核系统中表达了pfmag-1基因的三个预测高抗原性片段,获得重组蛋白PfMAg-1-N,PfMAg-1-M,和PfMAg-1-C,免疫新西兰大白兔后制备抗血清纯化IgG,证实三种IgG在体外培养中均可抑制3D7株恶性疟原虫的生长,其中以抗C端重复结构域抗体最为有效,抑制率可以达到73%。证明PfMAg-1蛋白的C端重复结构域是M26-32识别的保护性B细胞表位。 在Western blotting实验中,我们发现无论是抗PfMAg-1-C的特异性多克隆抗体还是抗PfMAg-1 N端的单克隆抗体,均可从各期混合的感染红细胞抽提物中识别出两条蛋白带,即预测的70KDa条带和另一条50KDa左右的条带,而在富集的成熟裂殖体抽提蛋白中则只识别后一条短带,提示PfMAg-1可能在红内期发育的晚期经了酶解过程。 由于皂素处理感染红细胞后,仅在感染红细胞膜以及纳虫空泡膜上“打孔”,而疟原虫细胞膜不受影响,使识别疟原虫细胞膜表面蛋白的抗体可以穿过红细胞膜和纳虫空泡膜进入感染红细胞,结合在疟原虫细胞膜表面。我们经过percoll富集的成熟裂殖体后,发现anti-pET30a-PfMAg-1-C IgG抗体可标记在皂素处理的晚期感染红细胞中的裂殖子表面,而不未处理的晚期感染红细胞。证实PfMAg-1蛋白的C端重复区位于裂殖子细胞膜表面,与免疫电镜结果一致。 PfMSP-1蛋白(2,3)和PfMSP-4(4,5)蛋白是位于裂殖子表面的保护性蛋白。本试验使用抗PfMAg-1-N片断的单抗X6-2C分别与MSP-1和MSP-4兔抗血清对裂殖子进行双荧光标记实验,发现三种抗体的荧光分布模式基本一致,随后使用X6-2C进行免疫电镜观察,则确定X6-2C单抗识别的PfMAg-1蛋白肽段位于成熟裂殖体期的裂殖子胞浆内。 通过将PfMAg-1提交到NCBI在线工具BLAST进行分析,检索到与PfMAg-1高度同源的一条伯氏疟原虫基因部分序列(基因登录号为XP_678342.1),二者的同源性为75%。该序列注释表明3'端完整,仅缺乏5'端编码区。然而,我们根据该核苷酸序列设计引物后进行RT-PCR,发现实际序列在1089bp处有一个额外的碱基A插入,经3'-RACE实验证实该碱基插入确实存在,由此获得完整正确的3'序列,命名为pbmag-1。其编码的蛋白PbMAg-1氨基酸序列中缺乏与PfMAg-1类似的C端十肽重复结构域。而PfMAg-1 C端十肽重复区与另一个鼠伯氏疟原虫蛋白同源,提示PbMkg-1与PfMAg-1的功能并不完全一致。 我们将获得的包括完整3'-末端的pbmag-1序列克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,通过优化诱导条件,降低宿主的代谢水平,降低诱导剂的浓度,克服了疟原虫基因在大肠杆菌中表达存在的密码子偏爱问题,以包涵体方式表达出PbMkg-1/pGEX融合蛋白。用该融合蛋白包涵体免疫BALB/c小鼠,获得的抗血清在免疫印记实验中可以识别一条分子量为64kDa的伯氏疟原虫感染红细胞天然蛋白。通过与同源蛋白pfmag-1序列的比较,分析该cDNA片断覆盖了PbMAg-1蛋白全长的大部分编码区。 用PbMAg-1融合蛋白免疫小鼠后,受试动物对伯氏疟原虫感染并未产生免疫保护。PbMAg-1融合蛋白免疫小鼠的血清过继保护实验也验证了上述结果。这表明本实验中PbMAg-1重组蛋白免疫诱导产生的抗体不是保护性抗体。分析原因与PbMAg-1序列缺乏PfMAg-1的C端重复结构域有关;同时由于未能解决复性问题,用包涵体免疫动物,缺乏天然构像的PbMAg-1蛋白也可能影响保护性抗体的产生。 本试验首次使用新型分离介质Optiprep成功分离晚期感染红细胞,并对这种介质对疟原虫的活性影响进行了初步研究,结果表明,分离晚期感染红细胞的效果与广泛使用的Percoll分离法接近,但是对细胞的毒性要低于后者,因此可以替代percoll分离晚期感染红细胞,用于对疟原虫活力有要求的生物学实验。 我们还尝试通过基因敲除方法探讨PbMAg-1/PfMAg-1的生物学功能,然而由于转染技术的瓶颈,未能成功。尽管如此,通过这项实验,仍然积累了一些有益的经验,有利于以后实验的完善和改进。 通过以上研究,获得了一个新的恶性疟原虫红内期保护性候选抗原基因,其表达产物的免疫保护区域主要位于C末端的十肽重复结构域,该结构域作为B细胞表位可以用于新疟疾候选疫苗的进一步研究。