收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

抗SSA/Ro 60kDa抗原表位特异性单克隆抗体的表达和致病机制的研究

李洁  
【摘要】:研究背景 抗SSA/Ro 60kDa抗体见于多种自身免疫病患者,生理状态下与SSA/Ro52核蛋白及hYRNA共同构成核糖核蛋白复合体SSA/Ro抗原。系统性红斑狼疮(SLE)患者血清抗Ro抗体阳性率高达50%,而干燥综合征(SS)患者血清阳性率在50%以上。最初人们使用双扩散法在抗核抗体(ANA)阴性的SLE患者血清中发现该抗体。此后在SS的患者血清中证实为SSA。抗SSA/Ro 60kDa抗体除了和某些临床表现相关,还和HLA表型和T细胞受体基因有关。出现Ro沉淀线的血清都有抗60kDa的抗体存在,与SSA/Ro 60kDa抗原结合的hYRNA有四种,结构短并且富含尿嘧啶。在部分抗SSA/Ro 60kDa抗体阳性的血清中往往出现抗SSA/Ro 52kDa抗体。SSA/Ro 60kDa-hYRNA和SSA/Ro 52kDa的关系尚有争议。Scofield等研究SSA/Ro 60kDa蛋白7个氨基酸残基的寡肽,发现了20个明确的抗原表位,并且发现患者血清和这些表位的结合情况有较大差异。使用合成的60-kDa Ro表位多肽免疫BALB/c鼠,出现针对整个抗原颗粒的抗体,这和人类的SLE或SS相似。而且免疫后的小鼠唾液流率较对照组下降,唾液腺出现炎细胞浸润。 本课题首先成功构建了抗Ro抗体单链可变区(Single-chain Fv,ScFv)噬菌体抗体库,根据课题组初步临床研究的结果,人工合成SSA/Ro60kDa抗原3个表位多肽(P1表位:482~493,P2表位:310~323,P3表位:230~241),用3个多肽从ScFv噬菌体抗体库中筛选获得3个ScFv单抗。通过这三个表位特异性抗体研究SLE动物模型肾脏SSA/Ro 60kDa抗原表位的表达,解释SLE发病的相关机制。 研究目的 1、验证利用噬菌体展示技术表达抗SSA/Ro 60kDa抗原表位特异性抗体。获取3个抗SSA/Ro 60kDa抗原的表位特异性抗体,使用镍柱进行纯化。 2、利用获得的抗SSA/Ro 60kDa表位特异性抗体研究MRL/lpr和BALB/c鼠肾脏SSA/Ro 60kDa不同表位的表达。 方法 1、对接收克隆进行序列分析,提取质粒,制作感受态细胞。将质粒转化于大肠杆菌ORIGAMI,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达。SDS-PAGE胶电泳分析表达是否成功。Western-blot检测目的蛋白中是否带有6×His标签,使用镍柱进行蛋白纯化。 2以小鼠SSA/Ro 60kDa抗原为底物,ELISA法检测抗体活性。用Hep-2细胞为底物,间接免疫荧光等方法检测抗体活性。 3、对MRL/lpr和BALB/c两种鼠模型,通过免疫组化法分析肾脏、脾脏、肝脏等SSA/Ro 60kDa抗原不同表位表达的情况。利用专业图像软件分析SSA/Ro 60kDa抗原表位和器官损伤之间的关系。 结果 1、对接收克隆的插入基因进行序列分析,提示插入基因序列与此前提供的测序结果完全符合,插入基因未发生突变。pET32a(+)质粒成功转入表达菌ORIGAMI。经IPTG诱导目的蛋白表达,SDS-PAGE胶电泳发现相应分子量的目的蛋白大量表达。Western-blot提示目的蛋白均带有6×his标签。经Ni柱纯化蛋白,获得相应的单链抗体。 2、以小鼠SSA/Ro 60kDa抗原为底物,ELISA法检测抗体活性,结果显示三种单抗反应均为阳性。以Hep-2细胞为底物,间接免疫荧光法检测抗体的在体活性,结果显示,三种抗体均和Hep-2细胞结合,胞浆及胞核均有荧光染色,符合抗SSA抗体间接免疫荧光法检测的荧光特点。 3、MRL/lpr小鼠模拟人自身免疫性疾病系统性红斑狼疮和继发性干燥综合征。HE染色提示20周龄MRL/lpr小鼠肾脏出现大量炎细胞聚集,类似狼疮肾炎的病理改变。同周龄的BALB/c小鼠肾脏未出现病理改变。 4、MRL/lpr组和BALB/c组肾小球、近端肾小管、远端肾小管、集合管胞浆及胞核均可见棕黄色颗粒。Image-pro plus软件分析结果显示,MRL/lpr组和BALB/c鼠P1、P2、P3阳性表达的积分光密度(IOD)值差异无统计学意义。MRL/lpr组及BALB/c组内P1、P2、P3的IOD值,差异无统计学意义。 5、统计细胞核阳性率,MRL/lpr组P3细胞核阳性率高于BALB/c组,差异有统计学意义(p<0.05)。 6、MRL/lpr组内P1、P2、P3细胞核阳性率差异有统计学意义(F=4.74,p<0.05)。MRL/lpr组内两两比较发现P3表达高于P1、P2表位,差异有统计学意义(p<0.05)。BALB/c组内P、P2、P3细胞核阳性率差异无统计学意义。 7、MRL/lpr小鼠脾脏增大,肝脏、心脏等实质性脏器未见明显淋巴细胞浸润。两组小鼠脾脏P1、P2、P3表位表达均为阴性;两组小鼠肝脏组织P1、P2、P3染色均为胞浆弥漫淡棕色,胞核无着色。 结论 1、利用噬菌体展示技术可以成功表达抗SSA/Ro 60kDa抗原表位特异性抗体。 2、获得的SSA/Ro 60kDa表位特异性单链抗体具备良好的抗原结合能力,可以用于动物模型研究。 3、自身免疫状态下SSA/Ro 60kDa表位的核表达上调。SSA/Ro 60kDa aa230~241表位可能参与炎症反应。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 张娟;张君;余晓林;吴倩;蒋飞龙;黄长武;李兴禄;黄爱龙;郑建;;特异性O1群稻叶型霍乱弧菌单克隆抗体的制备、筛选及识别抗原表位的分析[J];第三军医大学学报;2008年15期
2 王佑春,李河民,胡宗汉;针对HBsAg α决定簇不同表位单克隆抗体的筛选及某些特性的研究[J];细胞与分子免疫学杂志;1992年01期
3 黄启华,吴子松,高鹏,张桂威,邱东川,周国兴,山建忠,蔡兴平;识别血吸虫成虫多肽表位单克隆抗体细胞株的建立及用于检测循环抗原的研究[J];中国人兽共患病杂志;1996年05期
4 马靖;含B细胞表位的重组抗体能诱发构象特异性抗体应答[J];国外医学.预防.诊断.治疗用生物制品分册;1996年06期
5 闭兰;对HIV疫苗应答与对HIV应答的区别[J];国外医学.预防.诊断.治疗用生物制品分册;1998年03期
6 范宝剑;人体对丙型肝炎病毒表位免疫应答的分析[英][J];国外医学.预防.诊断.治疗用生物制品分册;1999年03期
7 黄峙,杨红宇,向军俭;应用噬菌体展示技术研究过敏原表位的新进展[J];现代免疫学;2004年04期
8 韦三华;尹文;雷迎峰;胡兴斌;杨敬;吕欣;孙梦宁;徐志凯;;稳定表达丙型肝炎病毒复合多表位基因P815细胞克隆的建立[J];第四军医大学学报;2006年01期
9 樊建勇;杨慧兰;关蕾;王颖;仕瑶慧;;单纯疱疹病毒2 gD蛋白T细胞表位区的预测及克隆[J];中国皮肤性病学杂志;2007年06期
10 熊君辉;郭清顺;葛胜祥;顾颖;陈毅歆;苗季;杜海莲;史维国;张军;夏宁邵;;抗戊型肝炎病毒单克隆抗体识别表位的初步研究[J];病毒学报;2008年02期
11 郝晓娟;李端;陈丽萍;赵甫涛;赵英仁;贾战生;;中国人丙型肝炎病毒复合细胞毒性T淋巴细胞多表位基因真核载体的构建及在COS-7细胞中的表达[J];西安交通大学学报(医学版);2010年04期
12 郭华,章汪涛;T淋巴细胞抗原表位的预测[J];国外医学.病毒学分册;1999年01期
13 郑捷,康向东,李卫平,陈颖,唐敏珠,周文瑜;寻常性天疱疮抗原EC1-2和EC3-4表位的分子克隆与蛋白表达[J];中国免疫学杂志;2000年07期
14 汪毅,姚鹏;丙型肝炎病毒非结构蛋白及其抗原表位的研究进展[J];国外医学.病毒学分册;2000年01期
15 韩全利,丁杰,巩爱春,喻召才,乔泰东,陈宝军,张学庸,樊代明;胃癌相关抗原表位模拟短肽的筛选[J];细胞与分子免疫学杂志;2003年03期
16 王勇,吴海玮,张兆松,胡雪梅,刘丰,李春玲,季旻珺,吴观陵;日本血吸虫特异性IgE抗体相关肽表位的筛选与免疫学鉴定[J];中华传染病杂志;2004年06期
17 张念华;张晓实;;优化抗原表位在抗肿瘤核酸疫苗中的应用[J];中国医学文摘(肿瘤学);2004年04期
18 杨清浩,王祥卫,金燕,张立新;MUC1抗原的B细胞表位预测[J];第三军医大学学报;2005年05期
19 李元朝,吕凤林,曹伟,左国伟,艾军华,胡承香;人乳头瘤病毒11型L1主要衣壳蛋白的B细胞表位多肽作为疫苗的研究[J];病毒学报;2005年01期
20 付琳琳;沈光金;王勇;何家昶;季虹;郭见多;吴维铎;;日本血吸虫辐照尾蚴模拟表位的筛选和初步鉴定[J];热带病与寄生虫学;2005年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 潘志明;张晓明;焦新安;Richard Lo-Man;Claude Leclerc;刘秀梵;;重组减毒细菌运送CD8~+ T细胞表位的效应分析[A];全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2006年
2 吴静波;翁云层;丘金浪;李荣;黎诚耀;王文敬;;布鲁氏菌弱毒疫苗株M5-90 BP26和OMP31蛋白T细胞表位的鉴定[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
3 王书峰;;免疫表位数据库的现状及新型表位数据库的构思[A];第六届全国免疫学学术大会论文集[C];2008年
4 张小俊;孟颂东;;HLA-A24和-A33限制性B、C型乙肝病毒核心蛋白T细胞表位的鉴定与评价[A];2010年中国科学院微生物研究所博士后学术年会暨第二届博谊论坛论文摘要集[C];2011年
5 余剑琴;郑飞云;徐云升;欧荣英;张乾;;HPV18 E7抗原HLA-DRB1*0301限制性Th表位的鉴定[A];2011年浙江省妇产科学学术年会暨“妇产科常见疾病的临床研究新进展”学习班论文汇编[C];2011年
6 吴德铭;刘镇明;黄毓茂;罗满林;;抗PRV gE主要抗原表位单克隆抗体的研制[A];猪的重要传染病防治研究新成果——中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第五届理事会第二次全体会议暨防检疫专业委员会第7次学术交流会论文集[C];2002年
7 杜以军;姜平;杨晓玮;汤景元;李玉峰;李永东;;猪口蹄疫病毒多抗原表位重组腺病毒的构建与鉴定[A];第六届全国会员代表大学暨第11次学术研讨会论文集(上)[C];2005年
8 杜玲;王惠菊;杨建民;高寒;周永列;陶厚权;;Th线性肽对人肝素酶B细胞表位多抗原肽的免疫增强作用[A];首届浙江省消化病学术大会论文汇编[C];2008年
9 胡雪梅;张兆松;吴海玮;李春林;苏川季;王诗宁;王勇;吴观陵;;日本血吸虫线粒体相关蛋白的表位筛选及其免疫保护性研究[A];中国动物学会第八次全国寄生虫学学术讨论会论文摘要汇编[C];2001年
10 张艳;郑龙;宋淑霞;魏林;;对携带HCC表位的HBc病毒样颗粒负载的DC疫苗的免疫评价[A];河北省免疫学会第六次免疫学大会资料汇编[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 李洁;抗SSA/Ro 60kDa抗原表位特异性单克隆抗体的表达和致病机制的研究[D];中国协和医科大学;2009年
2 王雅英;北京地区人博卡病毒流行率调查及表位研究[D];北京协和医学院;2011年
3 李光富;日本血吸虫复合表位及其在CpG ODN协同下诱导的Th1应答对小鼠的免疫保护作用[D];南京医科大学;2004年
4 林治华;QSAR分析结合实验方法用于T细胞表位快速筛选的研究[D];第三军医大学;2003年
5 李长岭;PfCP-2.9疟疾疫苗候选抗原系列突变体的构建及其表位和免疫学分析[D];第二军医大学;2010年
6 杨玲;乙型肝炎病毒变异与慢加急性肝衰竭发病关系的研究[D];南方医科大学;2010年
7 高军;丙型肝炎病毒多表位抗原的基因合成与免疫原性研究[D];第二军医大学;2004年
8 殷瑛;以乙型肝炎病毒核心蛋白为载体的新型疫苗研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2010年
9 沈柱;特异性置换肽下调银屑病自身反应性T细胞功能的研究[D];第四军医大学;2005年
10 陈安;一个新的HBcAg之H-2K~d限制性表位的鉴定及其功能特性研究[D];第三军医大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 赵犇鹏;日本血吸虫童虫期抗原分子的筛选及其Th细胞表位的鉴定[D];上海师范大学;2011年
2 刘新生;口蹄疫病毒AF/72株结构蛋白VP1的H-2d限制性T细胞表位筛选与鉴定[D];中国农业科学院;2011年
3 张丽婷;结核分枝杆菌分泌蛋白64抗原模拟表位的筛选研究[D];山西医科大学;2010年
4 张伟;淋球菌LOS 2C7表位筛选及其与HBc融合蛋白的免疫效果评价[D];西北农林科技大学;2010年
5 张宁;以改造隐性表位为基础的HIV复合多表位疫苗的构建及其免疫应答分析[D];第四军医大学;2010年
6 王新军;日本血吸虫抗原T细胞表位的筛选与鉴定[D];南京医科大学;2004年
7 杨秋虹;Derp2 DNA表位疫苗对哮喘小鼠气道变态反应炎症和Toll-9受体的影响[D];泸州医学院;2010年
8 吕虹;结核杆菌抗原CFP21的CTL表位筛选与改造[D];郑州大学;2010年
9 文学方;牛乳中α-乳白蛋白的表位定位研究[D];南昌大学;2010年
10 祖春波;PRRSV-Nsp2中B细胞线性表位的鉴定与分析[D];西北农林科技大学;2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 朱娟何勇;点滴汇就“明星”风采[N];中国电力报;2007年
2 ;买房子——把好最后一关[N];中华建筑报;2002年
3 ;何谓 移表 改类[N];西南电力报;2002年
4 ;居民用电有讲究[N];西藏日报;2000年
5 曾耀英;HIV疫苗 研究思路[N];中国中医药报;2006年
6 束洪福;丙肝疫苗研究有新进展[N];科技日报;2008年
7 河北 吴新年;“自动编号”巧改良[N];电脑报;2004年
8 张中桥;胃癌免疫治疗研究有新进展[N];中国医药报;2002年
9 牛立新戴斌;东至供电着力整治临时用电[N];中国电力报;2007年
10 柯伟;免疫信息学的研究专家[N];科技日报;2007年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978