精子发生过程中组蛋白H2A.H2B编码及功能研究

【摘要】：研究目的: 哺乳动物精子发生过程(Spermatogenesis process)是一被精确调控的复杂的细胞分化过程。原始生殖细胞经有丝分裂,两次减数分裂和变态过程最终发育成成熟精子。该过程中最显著的一个特点就是染色体重建(Chromatin remolding),其机制主要从两个方面来解读,第一,精子发生过程中有大量不同种类的组蛋白合成;第二,这些组蛋白的翻译后修饰可能呈现时间及空间特异性。“生精细胞特异的组蛋白编码”这一概念也随之提出,而目前还没有这方面系统的研究。 为了更好地理解精子发生过程中染色体重建。本研究应用质谱技术分析了参与精子发生的组蛋白H2A.H2B的亚型种类,组蛋白H2A.H2B翻译后修饰的动态变化,初步探索了相应翻译后修饰的功能。 研究方法: 首先应用密度梯度沉降的方法分离精原细胞,精母细胞和圆形精子细胞;分别纯化各细胞的组蛋白,应用HPLC进一步分离纯化组蛋白各组分(H1,H2A,H2B,H3,H4)。纯化后的组蛋白H2A和H2B经蛋白酶酶切,应用LC-MS;LC-MS/MS分析H2A.H2B的亚型种类及其翻译后修饰。 联合应用Pull-down和免疫共沉淀的方法来鉴定识别组蛋白修饰基团的伴侣分子。 研究结果: 精子发生过程中,一共鉴定了7种H2A亚型,睾丸组织特异的组蛋白TH2A首先出现在精原细胞中。发现了一些新的位于H2A1 C末端的翻译后修饰,包括K99和K100的甲基化,K119的二甲基化和K96的乙酰化。 同时鉴定了6种H2B亚型。在此期间,睾丸组织特异的组蛋白TH2B的翻译后修饰呈动态变化:精原细胞中乙酰化TH2B的相对丰度最高,约有28.9%的TH2B为乙酰化状态;精母细胞乙酰化的TH2B降到了最低(8.3%),到了圆形精子细胞阶段乙酰化的TH2B约为11.2%。 同时也鉴定了几种TH2B的翻译后修饰,TH2B的N端呈高乙酰化修饰状态;在TH2B的C端,我们发现了T116的磷酸化和K117的甲基化(乙酰化),形成了两个新的“磷酸化开关”(phospho switch)。 蛋白-蛋白相互作用的结果提示,蛋白质TRRAP,CENP-E和PTP-BL可能是识别H2B PhT_(116)/AcK_(117)的蛋白因子,提示该组合修饰可能参与了减数分裂过程中的染色体分离。 另外,应用质谱技术描述了参与精子发生的组蛋白H1的多样性。 研究结论: 本研主要应用质谱技术描述了精子发生过程中组蛋白H2A和H2B的亚型种类及其翻译后修饰;鉴定了识别其特异修饰基团的蛋白质。该研究尽管还不尽完善,为进一步理解精子发生过程中染色体的重建奠定了基础。