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免疫营养素DHA协同5-FU抑制胃癌的基础研究与肠内营养治疗改善胃癌术后预后的临床研究

吴全  
【摘要】:第一部分ω-3多不饱和脂肪酸:二十二碳六烯酸联合氟尿嘧啶对胃癌协同抑制作用及机制的探讨 [研究背景]二十二碳六烯酸(DHA),属于ω-3多不饱和脂肪酸(ω-3 PolyunsaturatedFatty Acids,ω-3 Pufas)家族成员,研究证实它不仅具有供能改善营养状况的特性而且在体外实验中证实具有抑制多种实体肿瘤细胞增殖生长的抗肿瘤特性,但是仍有部分实验结果与此不同,有学者提出,ω-3 Pufas在体外环境中不具有普遍的杀肿瘤特性,只针对部分实体肿瘤细胞表现出拮抗作用,Pufas对恶性肿瘤的抑制作用可能具有细胞特异性。另外在我们前期研究中发现ω-3 Pufas的二十碳五烯酸(EPA)能增效表阿霉素对胃癌细胞的抑制作用,但是机制尚不清楚,故本研究拟在此基础上从细胞培养和动物实验两个水平进一步探讨DHA联合氟尿嘧啶(FU)对胃癌的作用和相关机制。 [研究目的]研究DHA与FU在体外和体内两个水平对胃癌细胞和人胃癌裸鼠移植瘤的影响,二者的联合抗癌效率,探讨DHA和FU联合抗癌的相关机制。为胃癌综合治疗提供新思路。 [研究方法]1.体外实验:首先采用MTT法检测两种抗癌介质对胃癌细胞SGC7901和MGC803的抑制作用,DHA对正常细胞株人胚肺成纤维细胞的影响,根据Chou-Talaly中效原理计算两抗癌介质的中效浓度以及判定联合应用时的相互作用关系;其次使用DHA和FU两种介质单用或联用干预胃癌细胞24h后依次进行:①Transwell小室检测胃癌细胞体外侵袭能力的改变,②流式细胞仪检测细胞周期变化,③硫代巴比妥酸法(TBARS)检测细胞膜发生脂质过氧化反应(LPO)生成终产物丙二醛(MDA)的水平,④荧光探针DCF检测细胞内活性氧族(Ros)水平,⑤AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率,⑥Western Blot法检测药物作用相应靶蛋白表达变化情况。2.体内实验:富含DHA的鱼油脂肪乳剂Omegaven和FU单用和联合干预人胃癌裸鼠移植瘤模型21天,观察裸鼠一般生长状况、体重变化、肿瘤体积和重量变化、移植瘤病理改变以及Western Blot检测移植瘤凋亡蛋白表达变化。 [结果] 体外实验: 1.低浓度DHA对HPF增殖无抑制作用, 2.低浓度DHA对胃癌细胞SGC7901和MGC803增殖有抑制作用,随作用剂量增加、作用时间延长而增强,呈剂量-时间依赖效应, 3.低浓度DHA联合FU有很强的增殖抑制作用,两介质联合应用时的中效浓度均比单用时显著降低(按Chou-Talaly中效原理计算),二者联用在抑制作用达30%时合用指数CI<1,二者增殖抑制作用存在协同关系, 4.DHA和FU合用显著抑制SGC7901的体外侵袭能力,减少Transwell小室模型中穿膜细胞数, 5.两者合用共同抑制胃癌细胞生长停滞于G0/G1期, 6.DHA能诱发SGC7901发生LPO,FU几乎无此作用,两者联用未见LPO反应产物MDA水平升高,与DHA单用比较,差异无统计学意义,P>0.05,40μg/ml VitC对SGC7901无增殖或抑制作用,预先用VitC干预16h后,DHA诱发LPO作用被削弱,MTT检测DHA与FU联用时对SGC7901增殖的抑制作用也被废除, 7.本研究所用的两种浓度的DHA(30、60μg/ml)能诱发较高水平的细胞内Ros,显著强于FU(12.5、25μg/ml),两者联用产生的Ros水平显著高于二者单用,P<0.05, 8.FU、DHA单用诱发SGC7901凋亡作用不显著,两者合用时,凋亡率显著升高,P<0.05, 9.Western Blot结果显示:FU上调bcl-2,对caspase-3表达无促进作用,DHA逆转FU的作用,并促进caspase-3表达,下调Cox 2表达,两者合用时bcl-2、cox2、Mn SOD表达下调,剪切型caspase-3上调; 体内实验: 1.与control组比较,Omegaven未见明显促进肿瘤生长,FU联用Omegaven能显著抑制移植瘤生长, 2.应用FU的小鼠体重丢失严重,加用Omegaven后有助于保护小鼠体重丢失, 3.Western Blot结果显示:Omegaven和FU联用较单用显著降低bcl 2表达。 [结论] 1.体外环境中,DHA不会刺激胃癌细胞的增长,在适宜浓度下能抑制胃癌肿瘤细胞而对正常细胞无抑制作用,从浓度标准分析,无法单独等同于化疗药物; 2.DHA与FU联用在体外环境中可以协同抗癌,增效FU对胃癌细胞的毒细胞作用,与FU单独作用相比,添加低浓度DHA可以减少FU的用量而不削弱抑制作用的效果: 3.DHA联合FU协同抗癌的作用可能与两者协同阻滞细胞周期于G0/G1期,DHA诱发脂质过氧化反应,进而二者协同形成大量活性氧族,引起细胞内环境氧化应激水平升高,细胞凋亡增多,分子层面的凋亡调控机制可能与DHA抑制或下调了FU引起的bcl-2表达增加,并促进caspase-3表达增加有关,同时可能还包括DHA下调Cox 2蛋白表达水平,与FU共同下调Mn SOD表达; 4.富含ω-3 Pufas(DHA、EPA)的Omegaven在裸鼠移植瘤模型中运用不诱导移植瘤的增长,联合FU时能显著抑制肿瘤的生长,而且与单用FU比较,Omegaven能防止小鼠体重的严重丢失,作用机制可能与两者联用诱发调亡相关。 第二部分回顾性分析一组胃癌手术后病人生存预后及肠内营养干预对胃癌术后病人近期预后和获益的影响 [背景] 根治性手术是胃癌病人首选治疗手段,但是并非所有接受根治性手术的病人能够术后长期生存,故影响病人术后生存的因素众多,如肿瘤本身生物学特性,手术的根治与否,可能还包括术后的综合治疗,同时,胃癌病人普遍存在营养不良,尤其术后发生营养状况恶化的几率更大。北京协和医院每年诊治胃癌病例较多,分析总结这些胃癌术后病人的生存情况以及肠内营养干预对术后近期的获益可促进今后治疗水平的提高。 [目的] 1.分析在我院行胃癌手术的病人术后1、3、5年生存率以及影响术后长期生存的独立危险因素。 2.分析术后3-6月内通过空肠造口管积极给予肠内营养支持的胃癌术后病人短期预后和收益。 [方法] 1.回顾性分析2002年12月至2003年12月在我院行胃癌手术的120例病人资料,收集这些病例的一般情况、临床病例资料、随访资料,EpiData3.0建立数据库,数据采集完成导入SpSS进行统计分析。 2.进行营养干预分析时入选2002年12月至2007年12月间29例胃癌手术中同期行空肠造口管病例为带管组,从进行生存分析的120例病人中选择32例未带空肠造口管病人为对照组(未带管组),比较两组病例在体重、BMI、TLC、Hb、Alb、化疗耐受、NRS 2002评分、Karporfsky(KPS)评分等方面的差异。 [结果] 1.生存分析结果 ①全组120例胃癌手术病人Kaplan-Meier分析1、3、5年生存率89.7%、45.1%、28.9%。胃窦癌1、3、5年生存率分别为94.0%、65.9%、42.0%,胃底贲门部癌1、3、5年生存率分别为79.4%、32.4%、16.3%,胃体、全胃癌1、3、5年生存率为81.6%、28.2%、12.1%,经log-rank检验,P=0.000。临床分期Ⅰ+Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ各期的1、3、5年生存率和中位生存时间分别为94.1%、82.0%、57.4%、68.0±0.000m(Ⅰ+Ⅱ期),89.1%、45.5%、21.6%、33±6.092m(Ⅲ期),81.4%、12.6%、8.4%、21±1.906m(Ⅳ期),经log-rank检验,P=0.000。 ②Log Rank检验筛选出:年龄(P=0.043)、手术方式(P=0.000)、根治度(P=0.000)、手术失血(P=0.025)、输血(P=0.000)、贫血(P=0.001)、肿瘤部位、大小、分化、LN转移、肿瘤T和TNM分期(P=0.000)是影响病人长期生存的独立因素 ③Logistic回归和Cox回归分析显示:肿瘤大小(Exp(β)/RR=1.598)、LN转移(Exp(β)/RR=1.599)、临床肿瘤分期(Exp(β)/RR=1.572)等肿瘤病理特征密切与胃癌术后长期生存相关,而且上述特征变量的等级越高,预后越差,死亡风险比例增加。 2.肠内营养干预分析结果 ①与围手术期比较,术后3-6个月内带管组29例病人与未带管组32例病人体重均有丢失。带管组病例体重丢失7.09±3.3Kg,未带管组平均丢失9.87±3.1Kg,带管组比未带管组体重丢失少,差异有统计学意义,P=0.020;带管组病例术前BMI与非带管组无差异,两组病例术后3-6个月时BMI均降低,P=0.000,带管组BMI减少2.4±1.0kg/m~2显著小于未带管组3.2±0.9 kg/m~2,P=0.041,同样,两组病例BMI术前术后变化差异有统计学意义,P=0.041, ②与术前比较,带管组病例手术后3-6月内NRS 2002评分≥3者减少,未带管组增加,两组间差异比较有显著性,P=0.000, ③与术前比较,带管组病例手术后KPS增加的病例的比例超过未带管组,差异有显著性,P=0.003, ④两组病人在TLC、Hb、Alb、preAlb、化疗副反应方面未见明显差异。 [结论] 1.本研究显示北京协和医院2003年施行胃癌手术的病例术后1、3、5年总体生存率89.7%、45.1%、28.9%,其中胃窦癌预后较好,胃底贲门部癌预后最差 2.年龄、手术方式、根治度、手术失血、输血、贫血、肿瘤部位、大小、分化、LN转移、浸润深度、肿瘤分期均是影响病人长期生存的独立因素,Logistic和cox危险因素回归分析显示肿瘤大小(RR=1.598)、LN转移(RR=1.599)、肿瘤分期(RR=1.487)等肿瘤病理特征为影响胃癌术后长期生存的独立因素;; 3.围手术期以及术后短期(3-6月)加强EN营养支持,能够有效减少因肿瘤消耗、手术应激以及化疗等因素造成的体重丢失,缓解营养不良风险机率,提高术后化疗的耐受。


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