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中药红景天对高糖条件下大鼠心肌微血管内皮细胞及其生长因子作用的实验研究

李娜  
【摘要】: [目的] 1.采用消化法体外培养出纯度较高的大鼠心肌微血管内皮细胞(MMVECs)备用。 2.与培哚普利作对照,观察红景天含药鼠血清对高糖条件下大鼠MMVECs的增殖活力、MMVECs上清液中血管内皮生长因子(VEGF)分泌量和MMVECs内VEGF基因表达水平的影响。 [方法] 新生5-7天Wistar大鼠,开胸心脏取材,用冷D-Hanks液反复冲洗3次,采用二次消化法(0.25%胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶消化)分离、培养MMVECs,利用差速贴壁法和亚细胞克隆法纯化MMVECs,用Ⅷ因子和CD31相关抗原进行鉴定。 取培养至第3代的MMVECs,在培养基中加入50mmol/L Glu、含50mmol/LGlu的红景天(NDK)高、中、低剂量含药血清和培哚普利(PD)含药血清进行培养,72h时行MTT比色实验观察MMVECs增殖活性的变化,透射电镜下观察MMVECs超微结构的变化,并检测MMVECs上清液中VEGF的分泌量及MMVECs内VEGF基因表达水平。 [结果] 1.成功培养出纯度较高的MMVECs,可用于该项实验研究。 2.MTT比色实验:各组随培养时间的延长,OD值有所上升,72h时各糖浓度下的OD值比48h上升显著,差异均有统计学意义(均P0.05)。72h时,与正常对照组比较,各浓度组OD值都有所降低,以50mmol/L和75mmol/L时OD值的降低最为显著(P0.01)。用50mmol/LGlu培养72h时,NKD低组和PD组的OD值较50mmol/LGlu组显著升高(均P0.01),但两组间比较差异无统计学意义(P0.05)。 3.透射电镜下观察:高糖条件下MMVECs出现指状突起,溶酶体增多,线粒体肿胀,粗面内质网扩张。NDK低组含药血清作用后能改善这种损伤,其作用与PD组相似。 4. ELISA法检测:高糖组、NDK高、中、低组和PD组MMVECs上清液中VEGF分泌量较正常对照组均显著降低(均P0.01);与高糖组相比,NDK中、低组和PD组MMVECs上清液中VEGF分泌量显著升高(P0.05,P0.01)。NDK低组和PD组比较,差异有统计学意义(P0.05)。 5. QT-PCR法检测:高糖组、NDK高、中、低组及PD组MMVECs VEGF-mRNA表达水平较正常对照组显著降低(P0.01)。与高糖组相比,NDK低组MMVECs VEGF-mRNA表达增高,差异非常显著(P0.01),PD组MMVECs VEGF-mRNA表达也增高,但差异无统计学意义(P0.05)。NDK低组与PD组比较,差异有统计学意义(P0.01)。 [结论] 1.采用二次消化法原代培养,经差速贴壁法+亚细胞克隆法纯化的新生Wistar大鼠MMVECs,经Ⅷ因子和CD31相关抗原免疫荧光鉴定后,纯度可达95%以上,可用于正式实验。 2.高糖对MMVECs的增殖有抑制作用。NDK低剂量组能促进高糖条件下MMVECs的增殖,其作用与PD组相近似。 3.透射电镜下能观察到高糖对MMVECs超微结构的损伤,NDK低剂量组能改善这种损伤,其作用与PD组相似。 4.高糖条件下,MMVECs上清液中VEGF分泌量及MMVECs内VEGF基因表达水平显著降低。NDK低剂量组可上调MMVECs上清液中VEGF的分泌量及MMVECs内VEGF的基因表达水平,其作用优于PD组。 体外培养MMVECs,与培哚普利作对照,观察中药红景天含药血清对高糖条件下MMVECs及其VEGF的影响。分别从细胞水平和分子水平,观察红景天对高糖环境下大鼠MMVECs增殖活力、MMVECs上清液中VEGF分泌量及MMVECs内VEGF基因表达水平的影响,为红景天临床防治糖尿病心血管病变提供实验依据。经检索国内外文献未见此方面报道,为本课题的显著创新点。


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