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血管内皮生长因子对肺癌细胞株药物敏感性影响的初步研究

陈刚  
【摘要】: 目的考察外源性血管内皮生长因子对体外培养的A549肺癌细胞增殖,细胞凋亡,化疗药物敏感性的影响,并观察VEGF-VEGFR2-PI3K/Akt信号通路在其中的作用。从而初步探讨VEGF对肺癌细胞生物学影响及机制。 方法分别在含有10%、0.5%、0%血清浓度的培养基中,加入不同浓度梯度外源性VEGF培养A549细胞,MTT实验检测VEGF对于细胞生长及生存的影响;确定顺铂、吉西他滨、多烯紫杉醇的适合作用浓度,MTT法比较加入与否外源性VEGF时A549细胞对上述化疗药物的敏感性;MTT法比较加入外源性VEGF时抑制VEGF-VEGFR2-PI3K/Akt信号通路与否对于A549细胞的药物敏感性的影响;Western-blot实验检测加入VEGF时细胞VEGF-VEGFR2-PI3K/Akt信号通路中Akt蛋白磷酸化的变化;流式细胞仪检测VEGF+化疗药物组与单纯化疗组相比,细胞周期及凋亡的变化情况。 结果1、向含10%及0.5%血清的培养基中加入不同浓度梯度外源性VEGF,细胞的增殖及凋亡变化不显著。应用不含血清的培养基培养A549细胞,MTT示分别加入50ng/ml,100ng/ml,500ng/ml外源性VEGF均能使促进其增殖及生存,流式细胞分析示加入100ng/m1外源性VEGF细胞S期及G2期比例增加,G1期比例下降。2、MTT法示在0.5%血清的培养基中应用适宜浓度的顺铂、吉西他滨、多烯紫杉醇杀伤细胞的同时加入外源性VEGF能够显著提高细胞生存,应用VEGF-VEGFR2-PI3k/Akt信号通路的抑制剂能够阻断这种效应,流式细胞分析示加入VEGF组与对照组相比化疗诱导的细胞凋亡明显减少。3、Western-blot实验示外源性VEGF对细胞中Akt磷酸化的激活作用于30分钟至2小时达到最强,随时间发展逐渐减弱,加入VEGF信号通路抑制剂能够减弱VEGF对Akt磷酸化的激活作用。 结论1、无血清培养基培养细胞时,VEGF可延长A549细胞的存活时间。2、向细胞培养基中加入外源性VEGF可拮抗顺铂、吉西他滨、多烯紫杉醇对于A549细胞诱导的凋亡作用。3、VEGF拮抗A549细胞的凋亡作用与VEGF-VEGFR-PI3K/Akt通路相关。 目的探讨由质粒载体介导的针对VEGF的RNAi对A549肺癌细胞中VEGF的表达、A549细胞增殖的影响及RNAi联合化疗药物对肿瘤的杀伤作用,为RNA干扰技术在肺癌治疗领域中的应用提供实验依据。 方法将携带有针对VEGF的RNAi表达框架的真核表达载体pRS-VEGF-shRNA质粒于DH5a大肠杆菌中扩增并进行测序鉴定,通过脂质体转染技术将该质粒转染入A549细胞,RT-PCR法检测VEGF mRNA表达被抑制情况,ELISA法检测培养细胞上清液中VEGF蛋白表达,MTT法检测转染该质粒对于A549细胞的增殖与凋亡的影响,MTT法检测RNAi与顺铂、吉西他滨或多烯紫杉醇共同作用时细胞的增殖与凋亡的变化。 结果1、质粒pRS-VEGF-shRNA进行扩增后,测序结果显示其具有能够抑制VEGF表达的shRNA序列。2、RT-PCR法示与对照组比较,48小时后质粒pRS-VEGF-shRNA转染组VEGF mRNA表达量显著降低。3、ELISA法示转染组细胞上清液中VEGF蛋白含量显著降低,与RT-PCR结果相一致。4、转染后48h,MTT法示质粒转染组细胞的与对照组相比细胞增殖及存活受到抑制。5、RNAi质粒与化疗药物共作用组较单纯化疗药物组细胞存活数减少。 结论1.质粒pRS-VEGF-shRNA能够成功转染入A549细胞,VEGF mRNA表达及VEGF蛋白分泌受到抑制。2.应用针对VEGF的RNAi阻断内源性VEGF表达后,A549细胞的增殖受到影响。3. RNAi能够通过抑制肿瘤自分泌的VEGF与化疗药物协同杀伤肺癌细胞。


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