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MicroRNA15a与多发性骨髓瘤生物学特性相关性的研究

张丽  
【摘要】: 【背景】多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是一种骨髓浆细胞异常增生的血液系统恶性肿瘤,目前仍无法治愈。染色体13q14缺失是MM最常见的遗传学异常,但该位点基因缺失与MM生物学特性的相关性一直未被揭示,针对该区域非编码RNA在MM中的研究就更为少见。MicroRNA15a即是定位染色体13q14上非编码RNA家族的成员之一,新近报道采用高通量比较基因组杂交方法发现MicroRNA15a在MM患者与正常人群中存在差异性表达。 【方法】①首先,采用原位免疫荧光(fluorescence in situ hybridization, FISH)和传统染色体核型分析方法探明各类人类骨髓瘤细胞系的遗传学特征,证实U266细胞具备染色体13q14缺失的遗传学特征后,确定选取U266为本次实验的主要研究对象。②采用脂质体Lipo2000转染方法上调U266细胞microRNA15a表达水平,通过流式和共聚焦荧光显微镜检测技术观察转染效率后,从肿瘤细胞增殖、迁移活力和耐药三个方面,比较转染前后U266细胞骨髓瘤细胞系的生物学改变。在耐药试验中,具体观察microRNA15a转染前后U266骨髓瘤细胞对MM主要治疗新药沙利度胺和新药重组人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体/凋亡素2配体(tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand, TRAIL, also known as Apo2L)的药物反应。③此外,采用RQ-PCR方法检测10例复发/难治MM患者CD138+磁珠分选骨髓瘤细胞的microRNA15a表达水平,采用FISH方法、应用Rbl和D13S19探针检测其染色体13q14缺失情况,并与其常规核型分析及临床资料进行比对。 【结果】第一部分Apo2L/TRAIL、thalidomide对MM生物学特性的影响:①U266细胞系存在单条染色体13q14位点缺失,选取为本次试验对象。②Thalidomide10、15、20、25、30、35μg/ml处理U266细胞24小时后,细胞生存率分别为88.91±7.43%、85.14±10.26%、82.32±8.65%、78.10±6.78%、76.64±3.68%、75.00±10.11%(P0.05),Apo2L/TRAIL1、10、100μg/ml处理U266细胞24小时后,细胞生存率分别为86.43±7.35%、78.29±6.60%、70.79±9.80(P0.05),说明U266细胞对沙利度胺、Apo2L/TRAIL天然耐药;10μg/ml thalidomide、1μg/ml Apo2L/TRAIL单独凋亡率为11.43±1.48%、17.16±1.33%,联合用药后凋亡率达28.95±2.35%,说明两药联合应用可表现相加性凋亡诱导效应。另一方面,与未用药组相比,1μg/ml Apo2L/TRAIL处理U266细胞后,细胞迁移能力提高1.21倍,10μg/ml thalidomide可部分抑制Apo2L/TRAIL促进的U266细胞迁移率至67.10%;同时,Apo2L/TRAIL单药处理组VEGF和MDR1的mRNA显著增高至7.96±0.56和7.46±1.21倍(P0.05),thalidomide可部分抑制Apo2L/TRAIL促进的VEGF的mRNA表达至2.04±0.28倍(P0.05),而对MDR1的逆转效应不明显,为6.92±2.19倍(P0.05);VEGF和MDR1/GP170蛋白水平的改变与对应mRNA改变基本一致。第二部分实验上调microRNA15a表达对MM生物学特性的影响:①转染上调U266细胞microRNA15a表达后,体外培养5天,转染组中87.94±2.58%细胞完成2代分裂,而未转染对照组中98.06±1.15%细胞完成3代分裂(P0.05);G1期细胞占转染组59.56±3.19%,多于未转染组中48.84±1.66%(P0.05),说明microRNA15a上调可减慢U266细胞分裂速度、抑制细胞周期G1-S期转变,从而抑制肿瘤增殖。与此同时,转染组细胞迁移率明显受抑,迁移率仅为17.7±3.22%,与无SDF-1a趋化组13.5±2.14%无显著差异(P0.05),且转染后VEGF表达量为56.22±27.13 ng/ml,显著低于未转染组中165.01±29.66 ng/ml(P0.05)。另一方面,microRNA15a上调后通过转录后水平明显抑制GP170蛋白/MDR1 mRNA水平表达;但不能逆转U266细胞对thalidomide和Apo2L/TRAIL的天然耐药。②在10例复发难治MM患者中,共有8例存在microRNA15a低表达,其中5例FISH结果显示染色体13q14缺失。 【结论】MicroRNA15a介导骨髓瘤U266细胞增殖、迁移及MDR-1/GP170耐药等多条途径,可能是参与MM发病过程的关键调节分子之一。靶向非编码RNA,尤其是针对microRNA15a的干预手段可能成为抑制MM进展的新的治疗策略。


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