抗肾间质纤维化的中药体外筛选及机制研究

【摘要】：肾间质纤维化,以胶原等细胞外基质(ECM)过度沉积及其导致的正常肾组织结构破坏为特征,几乎是所有原发或继发肾脏疾病进展到终末期肾衰的共同途径,一直以来都是是严重威胁人类健康和导致高致死率的疾病之一。迄今为止,临床还没有很好的防治方法和手段,因而寻找有效的临床药物治疗是目前亟待解决的问题。本文在回顾和总结近20年文献研究的基础上,应用新建立的体外筛选模型(二维模型),以大鼠NRK-49F肾间质成纤维细胞为研究对象,对有抗纤维化活性报道的中药复方、单味中药以及中药来源单体化合物的活性进行了系统的筛选,在筛选出有效化合物的基础上,从胶原分泌,细胞分化和细胞增殖等方面探讨有效单体化合物治疗肾间质纤维化的可能机制。 体外筛选二维模型建立在转化生长因子β(TGF-β1)诱导成纤维细胞的ECM过量沉积,利用天狼星红染料染色胶原实现对胶原的定量分析的基础上。本文对该模型的培养条件进行探讨,发现TGF-β1在Ⅰ型胶原蛋白包被的96孔细胞培养板(BD)显著的诱导NRK-49F细胞的ECM的大量聚集,且无细胞单层结构的破坏,模型成功率为76.7%,组内标准变异系数小于10%,因而可以作为研究二维模型的理想介面。在该模型上TGF-β1诱导成纤维细胞Ⅰ型胶原蛋白(?)COLA1(1),COLA2(1)和内源性TGF-β1的表达上调,与临床常用纤维化诊断指标相吻合。 通过文献调研,在对近20年中约300篇文献的回顾和整理分析的基础上选取22个中药复方,复方采用水提制备。二维模型的研究结果发现其中15个中药复方提取物,包括茵陈蒿汤,麻黄汤,益肝康冲剂,臌胀片,扶正化淤胶囊,益气活血方,小柴胡汤,清肝活血方,补中益气汤,补肾柔肝方,抗纤保肝汤,虎金片,柴苓汤,八味地黄丸,血隆冲剂在100μg／mL时显著的抑制ECM的聚集,且没有显著的细胞毒性。 综合考虑单味中药在15个活性复方中的使用频率以及文献报道等因素,选取10个单味中药,采用甲醇提取制备。二维模型的实验研究显示3个单味中药大黄,黄芩和丹参的提取物具有体外抑制ECM聚集的作用,其1C50分别为66.8μg/mL,31.8μg/mL,51.8μg/mL,且没有明显的细胞毒性。 对21个单体化合物的研究结果显示5个单体化合物(黄芩苷,黄芩素,大黄素,槲皮素,丹酚酸B)剂量依赖性的抑制ECM聚集而不呈现明显的细胞毒性。其IC50分别为黄芩苷45.9μM；黄芩素24.7μM；丹酚酸B5.0μM；大黄素13.6μM；槲皮素22.3μM。其中4个化合物(黄芩苷,黄芩素,丹酚酸B,大黄素)来源于大黄、黄芩和丹参。进一步探讨单体作用规律发现所有候选化合物中,黄酮类均具有较好的体外活性。 对具有潜在活性的5个单体化合物(黄芩苷,黄芩素,大黄素,槲皮素,丹酚酸B),采用荧光定量PCR,免疫荧光染色和Western blot对基因和蛋白表达进行分析发现,5个化合物在三维模型上均能抑制细胞节结的生成；均能显著的下调Ⅰ型胶原α1,α2的基因和蛋白表达；槲皮素,黄芩素,丹酚酸B,大黄素抑制a-SMA蛋白表达,提示它们可以作用于纤维细胞向纤维母细胞的分化。同时MTS细胞生存率实验和Brdu掺入实验结果显示,5个化合物均不同程度的抑制成纤维细胞增殖。 对黄芩苷和黄芩素的量效关系研究结果显示：在20-80μM剂量范围内,黄芩苷和黄芩素剂量依赖性的拮抗TGF-β1诱导的ECM聚集,但对基础水平的ECM聚集无影响。黄芩苷和黄芩素显著的抑制细胞增殖,但此剂量范围内不引起显著的细胞凋亡和细胞毒性。同时,Western blot、荧光定量PCR从蛋白和基因水平证实黄芩素和黄芩苷时间和剂量依赖性的抑制Ⅰ型胶原的基因和蛋白表达。Western blot和SEAP报告基因实验发现,黄芩素和黄芩苷作用于TGF-p1-Smad依赖依赖通路,时间和剂量依赖性下调内源性TGF-β1表达,抑制Smad3蛋白的磷酸化。 综上所述,本研究中采用新建立的体外纤维化筛选模型,确证15个中药复方,3个中药单味药和5个单体化合物的体外抗肾间质纤维化作用；证明活性化合物的抗纤维化作用是通过抑制胶原蛋白分泌沉积、抑制细胞增殖和抑制细胞分化等方面实现。本文的研究为从中药中寻找和发现新的抗纤维化候选药物提供了实验依据。