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反向遗传学技术制备H1N1流感病毒Vero细胞适应毒株的研究

周健  
【摘要】: H1N1流感是由起源于猪的流感病毒所致急性、热性和高度接触性的呼吸道传染病,其在临床上表现为突发高热、咳嗽、呼吸困难、衰竭、迅速康复或死亡。目前防治流感的最有效方法是接种流感疫苗。市面上所用的流感疫苗是以鸡胚为基质生产的灭活疫苗。使用鸡胚生产流感疫苗存在许多需要改进的方面,比如难于在短时间内提供足量的鸡胚生产疫苗不利于应对大规模流感暴发。限于鸡胚生产流感疫苗的局限性,开发细胞流感疫苗为当务之急。Vero细胞是WHO推荐用于流感疫苗生产的细胞基质,能够利用生物反应器进行大规模培养,在流感疫苗生产上有着广阔的应用前景。但大多数流感病毒在Vero细胞上生长性能较差,因此获得流感病毒Vero细胞高产适应株对于流感疫苗的生产具有重要意义。 本研究采用RT-PCR扩增出流感病毒的全部8个基因片段,并将它们连接到双向表达载体PHW2000上,通过测序比对后构建出了Vero细胞适应株A/yunnan/1/2005Va (H3N2)的基因组库。为流感病毒Vero细胞适应株选育及相关的研究打下了基础。 目前WHO推荐的部分鸡胚流感病毒疫苗株是利用反向遗传操作技术获得的。本研究采用以8质粒拯救系统为基础的反向遗传操作技术,将鸡胚高产适应株A/PR/8/34(H1N1)的PB1、PB2、PA、NP四个片段,与流感病毒Vero细胞适应株A/yunnan/1/2005Va (H3N2)的NS、M片段以及A/reassortant/NYMC X-179A (H1N1)的HA,NA片段组合在一起,拯救出一个新的流感病毒。 拯救出的病毒,在Vero细胞连续传代6代,病毒具有流感病毒典型的形态特征,经血凝抑制试验、免疫荧光、琼脂扩散试验及病毒HA、NA基因测序表明,拯救病毒为重组A/reassortant/NYMC X-179A (H1N1),具有在Vero细胞适应性的高产的生物学性状。动物体内试验表明对病毒对鸡胚和小鼠没有致病性,其免疫原性与A/reassortant/NYMC X-179A (H1N1)株鸡胚制备的病毒抗原相比没有显著性差异。本研究建立了Vero细胞高产适应疫苗株基因组库,并通过反向遗传技术制备流感病毒Vero细胞高产疫苗毒株。


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