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子宫内膜异位症体外细胞共培养模型的建立及细胞迁移和侵袭的研究

董喆  
【摘要】: 研究背景 子宫内膜异位症是一种育龄妇女多发病,近年来发病率呈上升趋势,其病变广泛,形态多样,到目前为止发病机制不清,具有侵袭、远处转移、复发等恶性生物学行为,治疗对策有限。 模型的建立对疾病发病机制的研究是一种重要手段,在对内异症的研究中,尽管已成功构建了很多模型,但仍然存在一些不足,最理想的动物模型来自猕猴和狒狒等灵长类动物,但其来源稀缺、价格昂贵,应用受到了很大限制。而大多数动物模型所选择的啮齿类动物和兔等无周期性月经,不发生子宫内膜异位症,用其构建内异症模型似乎并不合理。在细胞模型的建立上,单种细胞的培养无法模拟体内多细胞共同作用的模式,而体外多细胞共培养的方法也十分有限,Transwell是应用最为广泛的一种方法,但其无法对两种细胞的作用过程进行实时观察。 本研究与中国科学院国家纳米科学中心合作,该中心应用微流控技术与表面化学技术已成功构建了体外多细胞共培养体系,能在同一表面控制不同种细胞有序粘附,对多种细胞的微观生物学行为进行观察。然而目前该模型在生物学方面的应用未见报道。将该模型应用于子宫内膜异位症体外细胞共培养模型的研究中,可以观察子宫内膜基质细胞与腹膜间皮细胞之间粘附、侵袭的发生过程,从而可以在体外模拟逆流的经血中子宫内膜基质细胞进入腹腔后内异症发病的过程,对进一步阐释子宫内膜异位症的发病机制有重要的意义 研究目的 l、建立子宫内膜异位症子宫内膜基质细胞、腹膜间皮细胞体外共培养模型。 2、应用该模型,观察内异症患者(研究组)及非内异症患者(对照组)子宫内膜基质细胞与腹膜间皮细胞交叉共培养后,细胞运动、迁移及侵袭的微观行为,比较细胞共培养后行为的差异。 3、实时观察细胞共培养后相互作用的过程方法 1、取组织分离培养原代子宫内膜基质细胞和腹膜间皮细胞 2、设计制备PDMS印章 3、利用双孔道同时接种同一种细胞,进行愈合实验分别观察内异症及非内异症患者子宫内膜基质细胞、腹膜间皮细胞运动的差异。 4、内异症及非内异症子宫内膜基质细胞和腹膜间皮细胞交叉共培养并免疫荧光标记,每24小时拍照,比较两组细胞行为差异。 5、显微镜实时监测共培养体系中两细胞相互作用的过程。 6、尝试应用建立的模型探讨17β雌二醇、孕酮、Triptorelin对子宫内膜基质细胞及与腹膜间皮细胞共培养后细胞运动的影响。 结果 1、当孔道宽、高300μm时,孔道间距500μm,子宫内膜基质细胞密度5×106/l、腹膜间皮细胞3×105/l时在孔道内生长良好,2小时可贴壁牢固,揭膜后图案化好。 2、模型设计当愈合孔道宽度600μm时,子宫内膜基质细胞93小时两细胞条带可完全愈合,在内异症组及非内异症组无明显差异;腹膜间皮细胞24小时已完全愈合,运动速度快于子宫内膜基质细胞。 3、内异症患者子宫内膜基质细胞和腹膜间皮细胞共培养后,基质细胞向腹膜间皮细胞迁移,使腹膜间皮细胞数量减少,甚至消失 4、内异症患者子宫内膜基质细胞与非内异症患者腹膜间皮细胞共培养,腹膜间皮细胞向基质细胞方向迁移,基质细胞数量逐渐减少 5、非内异症患者子宫内膜基质细胞与内异症患者腹膜间皮细胞共培养,基质细胞同样可以使腹膜间皮细胞减少消失 6、非内异症患者子宫内膜基质细胞与腹膜间皮细胞共培养,两细胞各自生长,未观察到侵袭现象 7、17β雌二醇浓度为5nM及10nM, Triptorelin浓度为5×10-7g/ml时子宫内膜基质细胞运动距离与对照组有统计学差异;孕酮对子宫内膜基质细胞运动无影响。17β雌二醇浓度为10nM时,可加快子宫内膜基质细胞与腹膜间皮细胞共培养后细胞运动速度。 结论 1、本课题应用微流控技术成功建立了子宫内膜异位症体外细胞共培养模型。能在细胞学水平对两细胞作用过程进行实时观察。 2、通过研究组、对照组子宫内膜基质细胞和腹膜间皮细交叉共培养得出子宫内膜基质细胞对腹膜间皮细胞具有一定的侵袭能力,这与临床表现以及以往的组织学研究结果相符。 3、在内异症的发病过程中,腹膜状态有一定的相关性。 4、雌激素对子宫内膜基质细胞的迁移有一定影响,但仍需进一步验证。


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