普利醇抗帕金森病的药效学及其机制研究

【摘要】： 帕金森病(Parkinson's disease, PD)是一种中老年人常见的中枢神经系统变性疾病,发病率呈逐年上升趋势。目前PD的病因尚不明确,但与多种因素有关,如氧化应激、线粒体功能异常、兴奋毒作用、细胞凋亡及遗传因素等,上述多种因素造成了大脑黑质-纹状体多巴胺神经元变性而引发临床症状。 从20世纪60年代推出左旋多巴(levodopa, L-Dopa)治疗PD获得明显效果后,治疗PD的药物有长足的进展：多种多巴胺受体激动剂、各种酶抑制剂、受体阻滞剂、神经保护性药物、神经修复药物等对改善PD的症状、延长生存时问起着重要作用。尽管如此,由于新药开发的费用日趋升高、周期越来越长、安全性评价日益严格,因此,抗PD的药物开发在相当长的一段时间内仍将趋于平缓。目前临床上PD的治疗还是多采用化学药物疗法,因疗效不理想和副作用较大,寻找新的治疗手段和途径已成为迫切需要。 普利醇(Policosanol, Ocs)是从甘蔗蜡中提取的脂肪醇混合物,其主要成分为28醇,是一种与他汀类不同的新型调脂非处方药,作为药品,它可有效降低血清胆固醇水平,抗脂质过氧化,抑制血小板凝聚,抑制血管内皮平滑肌细胞的增生等,对外源性高胆固醇血症引起的动脉粥样硬化也有保护作用；作为保健品,主要是增强体力、精力和耐力。目前已在古巴和南美国家上市,在日本等国家其主要成分28醇也被制成运动员饮料。 用气相色谱法进行Ocs药动学研究,结果显示首次峰值出现在给药后的1h,第2个峰值在给药后4h出现,可见Ocs的吸收速度较快。且Ocs主要经过胆汁和粪便排泄,不经过肾脏排泄。毒理学研究显示,长期口服500mg.kg-1的Ocs(此剂量是最大治疗剂量的1724倍)未发现与其相关的任何毒性作用。Snider等人在1984年的临床初步研究显示,一定剂量的Ocs对帕金森病病人有一定的疗效。但其之后未见国内外相关研究报道。为此,本研究设计了体内、外试验,观察Ocs对PD动物模型和Mes23.5细胞的疗效,并探讨其可能的作用机制。 丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases, MAPKs)是广泛表达的丝氨酸／酪氨酸激酶,在哺乳动物细胞多种信号转导通路中起重要作用,MAPKs有3个主要家族：ERKs,JNKs和p38MAPKs。研究证实,MAPK信号转导通路存在于大多数细胞内,将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内,并引起细胞生物学反应。研究表明,该信号通路在神经细胞凋亡过程中具有至关重要的作用。本研究设计了在动物中脑水平上观察MAPKs各细胞因子在PD模型中的表达,1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的变化及Ocs干预的影响。 神经营养因子在神经保护和神经发生方面发挥重要的作用。尽管其具有“神经营养”的结论已得到科学界的广泛认可,但近年发现神经生长因子前体(proNGF)在受到损伤的或老年的神经退行性疾病中如阿尔茨海默病人(Alzheimer's disease,AD)脑内大量存在。研究显示,一定配基的比例(NGF:proNGF)和受体比例(TrkA:p75NTR:sortilin)对决定AD模型中神经细胞的生存和死亡至关重要。基于上述事实,本研究设计了在PD模型动物中脑水平上观察proNGF、NGF及其各自受体的表达,6羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的变化及Ocs干预的影响。 第一部分Ocs对MPTP致PD小鼠模型的药效学及其作用机制的实验研究 1.成年雄性C57小鼠随机分为5组：假手术组(Sham),腹腔注射等量生理盐水,0.5%CMC水灌胃；模型组(Model),腹腔注射MPTP(15mg/kgx4次),0.5%CMC水灌胃；Ocs低剂量组(Ocs-L,25mg/kg/d),造模方法同模型组；Ocs中剂量组(Ocs-M, 50mg/kg/d),方法同上；Ocs高剂量组(Ocs-H, 100mg/kg/d),方法同上。Ocs连续使用2w。 2.转杆运动测试发现模型组小鼠转杆时间明显低于假手术组(P0.05),而Ocs给药各组转杆时间明显高于对照组(P0.05),显示给予Ocs对四肢运动协调能力下降有明显改善作用；自发运动测试显示模型组小鼠5min内的自发运动次数明显低于假手术组(P0.01),而Ocs-H组5min内的自发运动次数显著高于模型组小鼠(P0.05),说明给予Ocs对小鼠自发运动次数下降有明显改善作用。 3.组织形态学表明,模型组小鼠纹状体区神经元有明显损伤,表现为多数神经元尼氏小体蓝色颗粒减少和胞浆空泡样变性,与假手术小鼠相比；Ocs-M和Ocs-H组小鼠纹状体区与模型组相比,尼氏小体增多,表明Ocs可对抗MPTP所致的神经元损伤。 4.Western blotting结果显示,与假手术组相比,可介导细胞凋亡的MAPKs家族3个信号通路因子活化形式p-Erk1/2, p-p38 MAPK、p-JNK在模型组小鼠黑质区蛋白表达含量均显著增高(P0.01或P0.001)；而Ocs各剂量组尤其是Ocs-M和Ocs-H组p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表达虽仍高于假手术组,但与模型组相比明显下降(P0.01或P0.001),而Ocs各组p-Erk1／2表达与模型组无统计学差异,表明Ocs可通过调节MAPKs家族p-p38MAPK、p-JNK蛋白表达来减少MPTP所造成的损伤。 Ocs可通过调节MAPKs家族信号转导因子p-p38 MAPK、p-JNK蛋白表达,减少MPTP引起的黑质纹状体通路的损伤来发挥其抗PD的作用,且Ocs抗PD药效学作用表现出一定的剂量依赖关系。 第二部分Ocs对6-OHDA致PD大鼠模型的药效学及其作用机制的实验研究 1.使用大鼠脑立体定位仪对筛模组大鼠单侧(右侧)脑纹状体行6-OHDA两点注射。术后第4w开始对大鼠PD模型进行旋转实验筛选,筛选成功模型当天随机分组,分为模型组(Model)、Ocs低剂量治疗组(Ocs-L,17.5 mg/kg/d)、Ocs中剂量治疗组(Ocs-M,35 mg/kg/d)、高剂量治疗组(Ocs-H,70 mg/kg/d)、假手术组(Sham)、正常对照组(Normal),每组均为12只。治疗组连续给予Ocs 2w,正常组、模型组及假手术组给予等量0.5%CMC水。 2.Apo诱导的旋转实验发现模型组大鼠30min内向健侧旋转运动次数与假手术组相比有极明显增加(P0.001),而Ocs-M和Ocs-H组30min内向健侧旋转运动次数与模型组相比明显减少(P0.05),说明Ocs可以改善6-OHDA对患侧黑质纹状体通路的损伤。MWM测试发现模型组大鼠寻台潜伏期明显延长,寻台速度明显下降,与假手术组相比(P0.05)；而Ocs组大鼠寻台潜伏期明显缩短,而寻台速度明显升高,与模型组相比,具有显著性差异(P0.05)。说明给予Ocs可改善6-OHDA模型鼠感觉与四肢协调运动能力。平衡杆测试发现模型组大鼠过杆潜伏期及过杆总时间均比假手术组延长,而Ocs各剂量组在过杆潜伏期和时间上与模型组均有显著性差异(P0.01或P0.001),说明给予Ocs可改善6-OHDA模型鼠运动始动性及运动平衡能力。 3.生化学检测结果提示,与假手术组相比,模型组患侧纹状体MDA含量明显升高,SOD和GSH-Px活性则明显降低(P0.05),而CAT活性及GSH含量虽然也有下降,但尚未达到统计学差异标准；而Ocs各剂量组均能在不同程度上对抗氧化酶活性降低及MDA生成增多,其中Ocs-H与模型组相比具有统计学差异(P0.05或P0.01),表明Ocs可对抗因6-OHDA所造成的细胞氧化损伤。而健侧各组间氧化还原各指标之间无统计学差异,说明患侧注射的6-OHDA引起的损伤没有影响到健侧氧化还原系统。 4.组织形态学表明,模型组大鼠纹状体神经元有明显损伤,表现为该区神经元尼氏小体蓝色颗粒减少和胞浆空泡样变性,OD值显著低于假手术组(P0.01)；而Ocs组小鼠尽管纹状体内也出现神经元减少的现象,但神经细胞内存在较多Nissl小体,其中Ocs-M和Ocs-H组OD值明显高于模型组(P0.05或P0.01),说明Ocs可对抗6-OHDA所致的神经元损伤。 5.免疫组织化学及荧光染色显示,模型组大鼠纹状体区神经元DNA明显受损,该区DNA氧化损伤标志物8-oxo-dG阳性细胞数显著高于假手术组(P0.001)；而DNA损伤碱基切除修复蛋白MTH1表达与假手术组比明显降低(P0.05)该结果说明6-OHDA可通过损害DNA修复机制来介导DNA氧化损伤。TH染色显示患侧纹状体内TH阳性神经纤维及黑质区TH阳性神经元比假手术组明显减少,Ocs-H组黑质区多巴胺能神经元升高且纹状体区的神经末梢OD值明显增高(P0.05),说明Ocs能保护黑质多巴胺能神经元及其在纹状体区的神经末梢。而凋亡小体染色及TUNEL染色显示Ocs可减少6-OHDA致纹状体区神经细胞的凋亡。 6. Western blotting实验结果显示,模型组患侧纹状体区proNGF及其下游复合受体sortilin/p75NTR表达明显高于假手术组(P0.05或P0.01),同时我们检测了介导凋亡的相关因子的表达,结果显示,模型组促凋亡因子p-JNK,p-53,内源性线粒体凋亡通路的cyt C, caspase-9, caspase-3, Bad, Bax蛋白均明显高于假手术组(P0.05),而抗凋亡因子Bcl-2表达明显低于假手术组；此外,我们还检测了NGF-TrkA-pAkt神经细胞存活通路的各因子的蛋白表达,模型组NGF,p-TrkA及p-Akt蛋白表达均明显低于假手术组(P0.01或P0.001)。而Ocs各组,尤其是Ocs-M和Ocs-H组与模型组相比,上述促凋亡相关蛋白表达均有不同程度的下降,并具显著性差异(P0.05),而抗凋亡相关蛋白表达均有不同程度的明显上升(P0.05)。综合以上结果说明,Ocs可以通过调节proNGF介导的细胞凋亡通路和NGF介导的细胞存活通路来对抗6-OHDA引起的纹状体区细胞的凋亡。 本部分研究结果显示,Ocs可通过减少内源性活性氧产物的生成,调节proNGF介导的细胞凋亡通路和NGF介导的细胞存活通路,进而减少6-OHDA引起的黑质纹状体通路的神经细胞凋亡来发挥其抗PD的作用,且Ocs抗PD药效学作用表现出一定的剂量依赖关系。 第三部分Ocs对MPP+致Mes 23.5细胞PD模型的药效学研究 100μmol/L MPP+作用于Mes23.5细胞12h后,模型组细胞[3H]多巴胺摄取能力与对照组相比明显下降(P0.001)；给予10-6和10-7M Ocs进行预保护12h后,与模型组相比,其多巴胺摄取能力明显上升(OP0.05),10-8M以下浓度Ocs预保护组,与模型组相比无统计学差异。说明Ocs可以对抗MPP+对Mes23.5细胞多巴胺摄取能力的损伤。 本部分研究结果显示,Ocs可对抗MPP+毒性,一定程度上恢复Mes23.5细胞的多巴胺摄取能力。