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DEDD与Smad3相互作用负性调控TGF-β介导的生物学活性

薛箭飞  
【摘要】: 转化生长因子β(TGF-β)是一类对细胞增殖、分化、迁移、凋亡以及细胞外基质形成、血管形成、免疫、发育均发挥调节作用的分泌型细胞因子。该家族调节异常可以导致各种疾病发生,例如肿瘤、纤维化、自身免疫性疾病以及血管性疾病等。TGF-β家族发挥其生物学功能主要通过Smads蛋白,Smads是TGF-β家族细胞内信号传导分子。目前在哺乳动物中已经发现八种Smads蛋白,根据功能不同可分为三类:受体激活型Smads、通用介质型Smads、抑制型Smads。TGF-β信号在整个传递过程中均受到不同层面的调节,因此TGF-β家族具有生物功能多样性。细胞内多种蛋白都可与Smads相互作用,这可以促进TGF-β信号与其他信号途径发生“整合”。 死亡受体结构域(Death effector domains, DEDs)是蛋白发生相互作用的区域,含有DED的蛋白可以介导由死亡受体触发的程序性细胞死亡或凋亡。DED本身没有酶活性而是作为其他DEDs的结合区域,因而促进蛋白复合体形成。FADD、caspase8以及DEDD均属于含有DED结构域的蛋白。研究表明,DEDD通过活化caspase3或capase6在CD95介导的凋亡途径中发挥重要作用。近来发现DEDD也参与细胞周期调控并抑制有丝分裂进程。然而,关于DEDD是否通过与关键的蛋白相互作用参与其他信号转导途径以及DEDD本身生物学功能尚未清楚。 我们实验室前期以全长的Smad3蛋白为“钓饵”,通过酵母双杂交系统筛选出DEDD与Smad3相互作用。本次研究中,我们应用免疫共沉淀和GST-pull down方法均证明DEDD与Smad3可以发生相互作用,这是首次报道Smad3与含有DED结构域蛋白之间的相互作用。我们发现TGF-β可以下调DEDD与Smad3的结合,而且DEDD与磷酸化的Smad3结合能力减弱。双荧光素酶报告基因实验证明DEDD通过其DED结构域可以抑制TGF-β/Smad3介导的转录活性,而且Smad3可以协同增强DEDD对NF-κB基因的转录。细胞免疫荧光染色和Western blotting实验证明DEDD可以抑制Smad3入核作用。免疫沉淀实验证明DEDD可以抑制Smad3磷酸化以及Smad3与Smad4复合体形成作用。Western blotting和RT-PCR实验证明DEDD抑制TGF-β靶基因的转录和翻译,而且TGF-β抑制DEDD蛋白表达和基因转录。细胞划痕实验和Transwell实验证明DEDD抑制TGF-β介导的细胞迁移和侵袭作用,而且DEDD本身也具有抑制细胞迁移和侵袭作用。Annexin V-FITC细胞凋亡检测实验和MTT实验证明DEDD本身可以诱导细胞凋亡和生长阻滞。最后,我们应用临床结肠癌病人组织标本进行免疫组化分析得到:与正常组织相比,DEDD蛋白表达在结肠癌病人组织下降。总之,我们的结果表明通过DEDD与Smad3的相互作用在TGF-β信号途径和CD95途径之间建立崭新的联系,DEDD成为TGF-β信号途径的抑制因素。


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