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附睾管腔液蛋白鉴定及精子表面GPI锚蛋白的探索性鉴定

王小强  
【摘要】: 目的:鉴定大鼠附睾管腔液中有可能参与精子成熟、贮存及保护的附睾管腔分泌蛋白以及精子表面的GPI锚蛋白。 方法:1,借助乙酰唑胺大鼠饲胃模型,采用电泳技术分离分析乙酰唑胺作用后附睾管腔液蛋白组份的变化;2,利用双向电泳结合质谱的蛋白质组学核心技术,分析鉴定正常成年大鼠附睾不同区段管腔液蛋白的差异,并采用RT-PCR.Western-blot.免疫组化技术对差异蛋白进行定性、定量、定位分析;3,纯化嗜水气单胞菌毒素,制备抗嗜水气单胞菌毒素多克隆抗体。使用嗜水气单胞菌毒素为蛋白探针,用Sandwich Western-blot法鉴定精子表面的GPI锚蛋白. 结果:1,成功建立了乙酰唑胺大鼠饲胃模型。乙酰唑胺作用后引起附睾精子的病理性变化,包括活动力下降、畸形率增加。但是,乙酰唑胺作用并未引起附睾管腔液蛋白组份的改变;2,从正常成年大鼠附睾头段及尾段管腔液的22个差异蛋白点中鉴定出12个蛋白质。其中11个蛋白质在不同种属哺乳动物的附睾组织中已有鉴定报道,而过氧化物酶(Peroxiredoxin6,Prdx6)为新发现的存在于附睾头段及尾段管腔液中的体液蛋白。RT-PCR.Western.blot及免疫组化技术进一步证实,该蛋白表达于附睾上皮细胞中并存在于附睾精子上,在附睾头部及尾部的表达量不同;3,本实验纯化出了高纯度有生物活性的嗜水气单胞菌毒素,自行制备了特异性强、效价高的抗毒素多克隆抗体。Sandwich Western-blot结果显示附睾精子表面有数种能被该毒素识别的GPI锚蛋白,分布在分子量为15-130kD之间。 结论:1,乙酰唑胺作用后能引起精子病理性变化,但是乙酰唑胺并不会引起附睾管腔液蛋白组份的变化。乙酰唑胺作用后出现的精子病理性变化与附睾管腔液蛋白的变化并无直接关系;2,过氧化物酶(Peroxiredoxin6,Prdx6)有可能参与附睾精子的成熟、贮存与抗氧化保护,该蛋白的具体机制有待进一步研究阐明;3,嗜水气单胞菌毒素能作为一种有效的生物探针,用于精子表面GPI锚蛋白的鉴定研究。


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