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TNF-α诱导肝细胞胰岛素抵抗的机制研究:NADPH氧化酶3源性活性氧的作用

李兰芳  
【摘要】: 目的:氧化应激在胰岛素抵抗以及糖尿病的发生中起着重要的作用。本研究旨在建立SD大鼠和肝细胞HepG2的胰岛素抵抗模型。观察喂养高脂饲料的SD大鼠肝脏中氧化应激以及胰岛素抵抗的发生。在体外应用TNF-α诱导的HepG2细胞胰岛素抵抗模型,分析胰岛素抵抗状态下活性氧(ROS)的变化,明确ROS的主要来源,研究TNF-α诱导肝细胞胰岛素抵抗的机制,侧重探讨NADPH氧化酶3(NOX3)在TNF-α诱导的肝细胞胰岛素抵抗中的作用。 方法:以高脂饲料喂养6只4周龄雄性SD大鼠12周,建立大鼠胰岛素抵抗模型。用优越血糖仪以电子感应法测定血糖,放射免疫法检测血清胰岛素水平,ELISA测定血清TNF-α浓度。RT-PCR分析肝脏组织中NOX3、P22PHOX、P47 PHOX、P67 PHOX和Rac1的表达,DHE染色观察肝脏组织中的ROS水平。在体外选用HepG2细胞,用TNF-α(4n/ml)刺激细胞4d,建立胰岛素抵抗细胞模型。蒽酮法测定培养细胞内糖原水平;用RT-PCR分析TNF-α刺激前后NADPH氧化酶(NOX)家族及其亚组分的表达谱变化;以DCFH-DA探针标记与流式细胞仪检测细胞内ROS水平;应用免疫荧光和Western blot观察P47 PHOX的膜移位;设计合成针对NOX3的小分子RNA(NOX3-siRNA),将其瞬时转染HepG2细胞以干扰NOX3基因的表达;用Western blot检测NOX3及其亚组分如P22 PHOX、P47 PHOX、P67 PHOX和Rac1的表达以及胰岛素信号通路中JNK、p-JNK、IRS1、p-IRS1、AKT、p-AKT、GSK和p-GSK水平。 结果:以高脂饲料喂养12周后,大鼠空腹血糖水平略有上升,但与对照组的大鼠相比无显著差异。而胰岛素敏感指数降低,血清TNF-α水平显著升高。蒽酮法的检测结果显示高脂饲料喂养大鼠肝组织糖原含量显著降低,表明肝组织发生了胰岛素抵抗。在胰岛素抵抗状态下,大鼠肝组织中NOX3的表达显著增加,DHE染色显示肝组织ROS水平显著增加,提示ROS在肝胰岛素抵抗发生中起重要作用。在体外实验中,细胞内糖原水平的检测结果显示,TNF-α处理后HepG2细胞内糖原合成量显著降低,表明TNF-α诱导HepG2细胞产生了胰岛素抵抗。TNF-α刺激HepG2细胞导致ROS水平呈浓度和时间依赖性增加。分别用ROS产生途径的抑制剂如NOX抑制剂DPI、线粒体呼吸链酶复合体抑制剂Rotenone、一氧化氮合酶抑制剂L-NAME和黄嘌呤氧化酶抑制剂Oxypurinol预处理HepG2后,再分别用TNF-α(4 ng/ml)刺激,结果显示DPI显著抑制TNF-α诱导的ROS产生,而其它抑制剂处理组的ROS水平无显著性变化。提示NOX是TNF-α诱导HepG2细胞产生ROS的主要来源。RT-PCR结果显示,HepG2细胞中主要表达NOX3及亚组分P22PHOX、P47 PHOX、P67 PHOX和Rac1。进一步应用Western blot分析NOX亚组分的表达变化,结果表明TNF-α处理后亚组分p22PHOX、P47 PHOX、P67 PHOX和Rac1的表达无明显变化,而Real-time PCR和Western blot的结果显示,TNF-α刺激后的NOX3的表达显著升高。观察TNF-α对NOX3活性的调节机理的结果表明,用PKC激动剂PMA预处理可引起TNF-α诱导的ROS水平进一步升高,而PKC抑制剂Hypericin能显著降低TNF-α诱导的氧化应激。培养的HepG2细胞中P47 PHOX主要分布在胞浆,而TNF-α处理后P47 PHOX发生明显的膜移位。P47 PHOX抑制剂Apocynin能显著抑制TNF-α刺激的P47 PHOX膜转位,并且能显著降低TNF-α诱导的ROS水平,表明TNF-α通过PKC途径和P47 PHOX的膜移位来调节NOX3活性。为了确定NOX3源性ROS在TNF-α诱导HepG2细胞产生胰岛素抵抗中的作用,我们将NOX3-siRNA转染HepG2细胞,获得低表达NOX3水平的HepG2细胞。分析ROS水平与胰岛素抵抗状态的结果显示,抑制NOX3基因表达后可下调TNF-α引起的氧化应激水平,并促进糖原的合成,改善胰岛素抵抗状态。说明NOX3参与了TNF-α引起的ROS的生成和胰岛素抵抗。在此基础上,我们进一步探讨TNF-α诱导HepG2细胞发生胰岛素抵抗的机制。结果显示,4 ng/ml TNF-α处理HepG2细胞后,伴随NOX3表达与ROS水平的升高,磷酸化的JNK和IRS1的307-Ser磷酸化水平增多,而IRS1的表达显著下调,胰岛素信号通路中AKT和GSK的磷酸化水平也下降。应用JNK抑制剂SP600125处理HepG2能抑制TNF-α的作用,引起JNK和IRS1307-Ser磷酸化水平下调,并提高AKT和GSK的磷酸化水平。干扰NOX3基因的表达也可以逆转TNF-α对胰岛素信号通路的影响,促进肝细胞内糖原的合成。这些结果表明,TNF-α通过NOX3介导的氧化应激诱导HepG2细胞产生胰岛素抵抗,其机理涉及到JNK/IRS1/PI-3K/AKT信号通路。 结论: 1.高脂饲料喂养12周的SD大鼠血清TNF-α水平显著升高,胰岛素敏感指数降低,肝组织中NOX3表达和ROS水平显著增加,糖原含量显著降低; 2.TNF-α主要通过上调NOX3的表达和活性显著提高HepG2细胞的ROS水平; 3.NOX3的激活主要通过PKC途径和p47 PHOX的膜转位; 4.TNF-α可诱导HepG2细胞发生胰岛素抵抗,其作用机制为:TNF-α可激活JNK信号通路,增加IRS1的307位Ser磷酸化水平,下调IRS1的表达,并显著降低AKT和GSK磷酸化水平,导致肝细胞糖原合成减少; 5.JNK抑制剂SP600125和干扰NOX3基因的表达可以抑制TNF-α引起的胰岛素抵抗。


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