收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

NCI-H929细胞系中CD20+与CD20-细胞具有不同的生物学特性及蛋白表达谱

耿传营  
【摘要】:NCI-H929细胞系中CD20+与CD20-细胞具有不同的生物学特性及蛋白表达谱 研究目的: 1.从NCI-H929细胞系中分选CD20+和CD20-细胞,明确两种细胞克隆形成能力及分化能力的差异。 2.探讨CD20+和CD20-的NCI-H929细胞蛋白表达谱的差异,验证其在mRNA和蛋白水平上的表达。 3.选择影响CD20+细胞增殖的关键差异蛋白,抑制其功能,探讨对CD20+细胞增殖能力的影响。 研究方法: 1. CD20+和CD20-的NCI-H929细胞分选 取对数生长期的NCI-H929细胞,制备单细胞悬液,每107个细胞加免疫磁珠分选缓冲液80μl,随后加阻断剂20μl,4-8℃孵育10min,然后加CD20磁珠抗体20μl,4-8℃孵育15min,免疫磁珠分选缓冲液清洗细胞,将免疫磁珠抗体孵育的细胞加入免疫磁珠分选MS柱中,分选CD20+和CD20-细胞。采用流式细胞仪检测NCI-H929细胞和分选后的CD20+和CD20-细胞的免疫表型。 2. CD20+和CD20-细胞的克隆形成及分化能力 取分选的CD20+和CD20-细胞,制备细胞悬液,培养于细胞克隆培养基中,培养基中细胞终浓度为1×10~3/mL,置入37℃5%CO_2培养箱中培养,14-21天后观察细胞克隆数,40个细胞记为1个克隆,计算形成率,检测CD20+和CD20-细胞的克隆形成能力。取克隆形成细胞,制成细胞悬液,重新接种于克隆培养基中,检测克隆形成情况,根据上述方法,再进行3次重新接种,观察实验细胞的自我更新能力。 取分选的CD20+NCI-H929细胞,加入培养基中,置于孵箱中培养,2周后,收集培养细胞,制成细胞悬液,分别加入抗人CD20、CD45、CD38和CD138抗体,流式细胞术的方法检测CD20+细胞抗原表达。 3.差异蛋白筛选 取分选的CD20+和CD20-细胞,总蛋白试剂盒提取细胞总蛋白,加入12%SDS-PAGE凝胶中进行电泳,将两组的蛋白质胶图进行分析后,将各组的所有条带分为10部分切下,每块切成直径2mm的小粒。萃取胶粒中蛋白质,使用胰酶溶液进行酶解,获得肽段干粉。TMT标记后,应用高效液相色谱分离与质谱鉴定两组间差异蛋白,Sequest软件鉴定筛选的差异蛋白。选取筛选的差异蛋白,应用在线数据库PANTHER (http://www.pantherdb.org/)对差异蛋白进行分类,应用人生物信息数据库STRING9.05(http://string-db.org/)分析差异蛋白之间的相互作用,筛选对CD20+细胞生物学特性具有重要影响的蛋白质。 4.差异蛋白验证 选取质谱鉴定出的差异蛋白,分别利用Real-time PCR和Western Blot的方法在mRNA和蛋白水平上验证差异蛋白的表达水平。收集CD20+和CD20-细胞,提取细胞总RNA,利用Real time PCR的方法从mRNA水平验证质谱鉴定的差异蛋白的表达;提取CD20+和CD20-细胞总蛋白,利用Western Blot方法从蛋白水平上验证质谱鉴定的差异蛋白的表达。 5.差异蛋白功能对细胞增殖的影响 根据生物信息学分析结果及文献报道,选择影响细胞增殖的差异蛋白质,利用差异蛋白Silencer siRNA和抑制剂干扰其功能,检测差异蛋白功能抑制后,CD20+和CD20-细胞增殖能力的变化,研究差异蛋白对CD20+细胞增殖能力的作用。 结果: 1. CD20+和CD20-的NCI-H929细胞分选 用流式细胞术检测H929细胞抗原表达发现,H929细胞表达CD38、CD138,不表达CD45;CD20+细胞的比例很低,且不稳定,约为0.1-1%,CD20-的骨髓瘤细胞的比率约为99-99.9%。分选的CD20+细胞表达CD20、CD45和CD38,CD138表达减弱。分选的CD20-细胞表达CD38、CD138,不表达CD20、CD45。 2. CD20+和CD20-细胞的克隆形成及分化能力 CD20+和CD20-细胞克隆在培养箱中培养2周后,CD20+细胞形成明显的细胞集落,但CD20-细胞的增殖能力较弱,形成较小的集簇。将CD20+细胞形成的克隆用培养基稀释,离心,制成细胞悬液,重新接种,再次进行克隆实验。在CD20+细胞形成的克隆细胞中,大部分细胞克隆再形成能力较弱,但仍有部分细胞可再次形成较大集落。但是,CD20-细胞进行连续传代培养后,逐步失去克隆形成能力,没有细胞可形成较大集落。 取分选的CD20+NCI-H929细胞,加入培养基中,置于孵箱中培养,2周后,收集培养细胞,制成细胞悬液,分别加入抗人CD20、CD45、CD38和CD138抗体,流式细胞术的方法检测H929细胞抗原表达。结果CD20+细胞培养后,CD20和CD45分子表达明显减低, CD38,CD138表达增强,细胞免疫表型恢复至典型的NCI-H929免疫表型状态。 3.差异蛋白筛选 选取分选的CD20-和CD20+细胞,进行质谱分析,共鉴定出1082种蛋白质,658种蛋白表达的差异超过1.5倍,与CD20-细胞相比,CD20+细胞中,205种蛋白表达上调,453种蛋白表达下调。PANTHER类别分析显示,差异蛋白参与的生物学过程主要有细胞通讯、转运、凋亡、系统过程、刺激应答、发育、代谢、细胞周期、免疫和黏附。差异蛋白参与最多的生物学过程是代谢(67.30%)、细胞进程(celluar process)(30.00%)和转运过程(17.98%)。与表达下调的差异蛋白相比,表达上调的蛋白中,参与细胞通讯、转运和细胞黏附的蛋白比例较高,参与其他生物学过程的蛋白比例较低。STRING相互作用分析显示,658种差异蛋白中,405种蛋白可与其它蛋白存在相互作用,其中60种蛋白形成核心网络,每种蛋白含有30个以上的节点,主要参与能量代谢、核苷酸合成和细胞增殖等维持细胞生命活动的过程。STRING分析74种参与细胞增殖、凋亡、代谢等信号通路的差异蛋白质,结果显示,61种蛋白可与其它蛋白存在相互作用,主要分为能量代谢、核苷酸合成代谢、泛素-蛋白酶体信号通路、细胞黏附转移和FAS信号通路5类蛋白。将目前文献报道的与细胞增殖密切相关的11种蛋白质联合74种差异蛋白进行分析,结果显示,75种蛋白存在相互联结,同样可形成5类蛋白群,同时TP53、AKT1、HSPA8等蛋白可于蛋白群形成密切联结,调控细胞的生命活动。 4.差异蛋白表达验证 从差异表达的658种蛋白质中,选择质谱分数大于20的15种蛋白质,同时选择6种与细胞增殖密切相关,但质谱未鉴定出的蛋白质,利用Real-time PCR的方法验证其在CD20+和CD20-细胞中的表达。Real-time PCR验证的基因表达变化与质谱鉴定的结果一致。选择上述21种蛋白质中与细胞增殖密切相关的13种蛋白,利用Western Blot的方法验证其在CD20+和CD20-细胞中的表达,Western Blot验证的基因表达变化与质谱鉴定的结果一致。 5. RNA干扰联合mTOR抑制剂对细胞的增殖抑制作用 CD20+细胞中,NANOG及SOX2基因表达增高,利用携带NANOG及SOX2干扰序列的慢病毒感染骨髓瘤细胞,表达特异性干扰RNA,降低NANOG及SOX2基因表达,检测其对骨髓瘤细胞增殖的影响。利用MTT的方法检测NANOG SilencerRNA、SOX2Silencer RNA及mTOR抑制剂RAD001对CD20+和CD20-细胞增殖的影响。结果发现,NANOG Silencer RNA及SOX2Silencer RNA不能有效抑制CD20+和CD20-细胞增殖,RAD001对CD20+细胞的增殖较抑制作用较NANOG SilencerRNA和SOX2Silencer RNA强,但无统计学意义,RAD001对CD20-细胞的增殖较抑制作用较NANOG Silencer RNA和SOX2Silencer RNA明显增强。三种药物联合应用后,CD20+和CD20-细胞的增殖受到明显抑制。 结论: 1.分选NCI-H929细胞中含有极少量CD20+细胞,其克隆形成能力较CD20-细胞强,具有自我更新和分化能力。 2. CD20+细胞与CD20-细胞具有不同的蛋白表达谱,差异蛋白参与的生物学过程主要有细胞通讯、转运、凋亡、系统过程、刺激应答、发育、代谢、细胞周期、免疫和黏附,相互之间形成密切网络。 3.利用CD20+细胞中表达增强的NANOG及SOX2干扰siRNA并不能有效抑制CD20+及CD20-细胞的增殖,联合mTOR抑制剂--RAD001后,CD20+和CD20-细胞的增殖受到明显抑制。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 黄蓓,车东媛,张婉蓉;缺氧内皮细胞培养液对肺动脉平滑肌细胞表型的影响[J];同济医科大学学报;1996年01期
2 魏虎来,裴新燕,姚小健;T-AK细胞的形态学和免疫表型研究[J];中国免疫学杂志;1998年04期
3 吴铭,孙雄飞,徐肇明,张新友,李富荣,王兴根,陈晓琳,林海清,文鸿光,孙璇,宋通微;基于细胞表型异常的流式细胞术检测急性前体B细胞白血病微小残留病[J];中国实验血液学杂志;2005年04期
4 段玉芹;程立军;郭兰涛;张素欣;陈彦平;陈中;;口腔癌患者外周血树突状细胞的体外培养及表型分析[J];实用口腔医学杂志;2007年06期
5 魏开鹏;潘兴南;王崇国;;两种成人骨髓间充质干细胞体外分离方法的比较研究[J];实用肝脏病杂志;2011年02期
6 冯明利,雍宜民,沈惠良,胡怀健;bFGF对体外培养的兔软骨细胞的胶原合成和稳定细胞表型的作用[J];首都医科大学学报;2001年01期
7 秦建平;蒋明德;;肝星状细胞的表型及调控与肝纤维化[J];世界华人消化杂志;2001年07期
8 程欣;体外肿瘤细胞引起的树突状细胞表型和移动性的变化[J];国外医学.免疫学分册;2002年06期
9 钟华,韩宝惠,董强刚,冯久贤,包国良,沙慧芳,苏建中;肺癌胸腔积液中树突状细胞的诱导培养及功能分析[J];中华结核和呼吸杂志;2004年08期
10 刘廷;原公强;于滨;董晓光;;增生性糖尿病视网膜病变增生前膜的观察及细胞表型的检测[J];眼科新进展;2009年10期
11 卓莉;蔡广研;刘伏友;傅博;;大鼠肾小球系膜细胞表型的增龄性变化[J];中国老年学杂志;2010年01期
12 胡朝英;钱柳;程伟志;黄秋愉;汪萍;余奇文;张继英;陈雪华;张冬青;;γδ T细胞诱导与分化的初步研究-Ⅰ[J];中国免疫学杂志;2010年04期
13 李莉;王元和;张玲珍;胡东平;张浩;连兆瑞;孔宪涛;;大肠癌浸润淋巴细胞的免疫活性及表型特征[J];中国免疫学杂志;1992年06期
14 王亦菁,金岩,史俊南,贺慧霞,杨锐,周泽渊,王彦亮;人牙髓干细胞培养及其细胞表型的分析研究[J];临床口腔医学杂志;2005年01期
15 蔡广研,陈香美,高波,张雪光,师锁柱,王兆霞;衰老大鼠肾小管间质细胞表型转化及意义[J];中国老年学杂志;2005年08期
16 张学荣;蒙怡;舒雨雁;韦敏;石庆秋;徐阳曦;;胎盘免疫调节因子对细胞因子诱导的杀伤细胞超微结构及免疫表型的调节作用[J];中国组织工程研究与临床康复;2007年23期
17 余莉;戴育成;李洁;邹湉;;白血病细胞源树突状细胞功能测定[J];郑州大学学报(医学版);2008年04期
18 刘运洪;孟明耀;解燕华;刘莹;魏传钰;侯宗柳;;人外周血淋巴细胞体外诱导培养前后细胞表型与细胞毒活性相关性研究[J];中国细胞生物学学报;2011年05期
19 李晓玲;朱旅云;赵芳;;脐带Wharton'sJelly中间充质干细胞的生物学特性[J];中国组织工程研究与临床康复;2011年32期
20 张宏伟;刘宇;杨野;张强;;c-Fos基因RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞表型及迁移的影响[J];中国医科大学学报;2011年08期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王珊;高志红;章镇;徐军霞;侯计华;;果梅完全花与不完全花的差异蛋白分析(摘要)[A];第二届全国果树分子生物学学术研讨会论文集[C];2009年
2 吴微微;王球达;葛锡锐;;抗CD_3、PHA-P及IL-2对LAK细胞培养的生长特性,细胞表型的影响[A];中国细胞生物学学会第五次会议论文摘要汇编[C];1992年
3 王红洁;;K562、U937细胞中过表达PTPalpha引起的细胞表型变化和基因、蛋白表达的差异[A];华东六省一市生物化学与分子生物学学会2006年学术交流会论文集[C];2006年
4 王志华;李鑫;;应用SELDI蛋白质芯片技术对高低转移肺腺癌细胞差异蛋白的初步筛查[A];第九届全国肿瘤生物治疗学术会议论文集[C];2006年
5 林祥明;林建峰;贺量;张茜;傅婉辉;陈清西;石艳;;菜青虫不同生长期相关蛋白的蛋白质组学研究[A];中国生物化学与分子生物学会农业生物化学与分子生物学分会第八次学术研讨会论文集[C];2008年
6 吴正正;严京;;蛋白质组学方法分析STZ诱导Ⅱ型糖尿病大鼠模型后视网膜差异蛋白变化[A];中华中医药学会第五次眼科学术交流会论文汇编[C];2006年
7 罗莹;杨云生;郭旭;彭丽华;王巍峰;孙刚;;便秘型肠易激综合征结肠黏膜组织差异表达蛋白质的筛选与鉴定[A];中华医学会第七次全国消化病学术会议论文汇编(上册)[C];2007年
8 吴正正;严京;;蛋白质组学方法分析STZ诱导Ⅱ型糖尿病大鼠模型后视网膜差异蛋白变化[A];中华医学会第十二届全国眼科学术大会论文汇编[C];2007年
9 李岩;康晓楠;郭坤;李雪飞;刘银坤;;小鼠胚胎干细胞定向分化为肝细胞的蛋白质组学分析[A];第十二届全国肝癌学术会议论文汇编[C];2009年
10 王志华;李鑫;;应用SELDI蛋白质芯片技术对高低转移肺腺癌细胞差异蛋白的初步筛查[A];2006年全国生化与生物技术药物学术年会论文集[C];2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 耿传营;NCI-H929细胞系中CD20+与CD20-细胞具有不同的生物学特性及蛋白表达谱[D];首都医科大学;2013年
2 张宁;边缘群细胞在肝癌发生和转移中的作用研究[D];第四军医大学;2010年
3 万亚锋;肝细胞癌AFPmRNA转染CD40配体活化的B细胞诱导抗肿瘤免疫的实验研究[D];华中科技大学;2010年
4 卢燕来;人γδT细胞对A型流感病毒血凝素蛋白及假病毒的免疫应答研究[D];北京协和医学院;2011年
5 杨丽娟;Th17细胞抗肿瘤作用及其机制研究[D];河北医科大学;2010年
6 周瑞;H-T-SCID嵌合体动物模型中EBV诱导的CD8~+NKT细胞抗EBV相关肿瘤研究[D];武汉大学;2010年
7 孙健;中国地区2371例淋巴组织肿瘤分布特点的分析及原发性肠道T细胞及NK细胞淋巴瘤的临床病理及分子生物学特点的研究[D];北京协和医学院;2011年
8 鲍嫣;新型B细胞亚群的发现及其免疫调控功能与机制的研究[D];第二军医大学;2010年
9 周静;牙髓、牙周组织中骨髓来源细胞特性的实验研究[D];第四军医大学;2010年
10 许杰;小鼠iPS细胞的诱导以及白血病抑制因子在细胞重编程过程中的作用机制研究[D];华中科技大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 刘晓芳;细胞间接触在诱导骨髓间充质干细胞向平滑肌细胞分化中作用的实验研究[D];第三军医大学;2010年
2 季亚娟;冠心病患者外周血T细胞亚群和NK细胞的变化相关性及临床意义研究[D];安徽医科大学;2010年
3 张艳;CHL瘤细胞与背景CD4~+T细胞关系的研究[D];南方医科大学;2010年
4 刘华;胸腺基质淋巴生成素对肺癌患者辅助性T细胞极化的影响[D];天津医科大学;2010年
5 黄方;结核菌素纯蛋白衍生物刺激人γδT细胞效应分析[D];重庆医科大学;2011年
6 崔莹莹;冻融抗原负载的DC-CIK细胞对SKOV3的杀伤作用[D];山东大学;2010年
7 陶盛能;CD4~+CD25~+调节性T细胞和再生障碍性贫血之间的关系[D];安徽医科大学;2010年
8 丁景弦;Huh7细胞中边缘群细胞分选及其增殖分裂能力的研究[D];南京医科大学;2010年
9 谭琳;慢性NK细胞淋巴增殖性疾病一例报告及文献复习[D];中国医科大学;2010年
10 任玲玲;TLR3和TLR7/8对小鼠妊娠子宫免疫功能的影响机制研究[D];暨南大学;2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 吴一福;军事医学科学院从MSCs中筛选出重要差异蛋白[N];中国医药报;2006年
2 张献怀;我国创伤修复研究取得新进展[N];中国医药报;2009年
3 记者 应洪舒;围绕胚胎后亚全能干细胞理论的相关研究完成[N];中国医药报;2006年
4 张献怀;我国创伤修复研究和临床治疗获新进展[N];大众科技报;2009年
5 张献怀;我国创伤修复研究和临床治疗取得新进展[N];科技日报;2009年
6 周勇;北京大学T淋巴细胞发育研究获新成果[N];中国医药报;2007年
7 本报记者 刘霞;诱导多功能干细胞遭遇“成长烦恼”[N];科技日报;2011年
8 王润华;幽门螺杆菌是胃癌“帮凶”[N];健康报;2007年
9 王润华;幽门螺杆菌是胃癌“帮凶”[N];中国中医药报;2007年
10 崔昕;表观遗传机制重大研究计划启动[N];中国医药报;2008年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978