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肝刺激因子敲减通过抑制线粒体融合影响非酒精性脂肪性肝炎的研究

盖曲倞  
【摘要】:背景与目的:非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指患者并无过量饮酒史,而由其他原因引起的类似于酒精性脂肪肝的肝细胞脂肪变性和炎症的一类肝脏代谢综合征。NAFLD在临床病理上分为三个阶段,单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH),肝纤维化和肝硬化,甚至最终发展为肝癌。目前认为,处于第一阶段的单纯性脂肪肝尚可已通过改变生活方式和饮食习惯来治疗,而一旦进入到NASH这一关键环节,则由于缺乏有效药物,难以彻底根治。因此,研究NASH的分子机制对疾病的预防具有至关重要的意义。肝刺激因子(hepatic stimulator substance,HSS)是1975年在初断乳的大鼠肝脏发现并提取的一种活性物质,具有特异性刺激活化状态下肝细胞增殖的特性,其基因名称为生长因子ERV1样基因(growth factor erv1-like gene,Gfer)。HSS可以保护肝细胞免受诸如CCl4,半乳糖胺等毒物所造成的损伤,同时还具有促进肝再生的作用。研究显示,外源注射HSS表达载体可以减轻小鼠肝脏脂肪变性,使NASH进程放缓。与之对应,降低小鼠肝脏内HSS的表达是否可以加快NASH进程。人们不禁要问,HSS是通过何种机制使NASH病情加重,迄今尚无定论。本实验应用我室繁育的HSS敲减型C57BL/6小鼠(Gfer+/-,即稳定低表达HSS的小鼠),依此复制NASH模型,探讨HSS表达下降对NASH发生发展的影响,并研究其中的分子机制,从而为NASH的预防及治疗提供新的分子靶点。实验方法:1、选取体重20-25 g的Gfer+/+与Gfer+/-C57BL/6小鼠,喂食含60%高脂的胆碱缺乏饮食(choline-deficient diet,CD diet),在第1 w的饮水中添加乙硫氨酸(终浓度为0.165%),自由饮用,第2 w即恢复正常饮水,持续喂养4 w和8 w,制备NASH小鼠模型。2、两组不同基因型小鼠分别于造模4 w和8 w后取血,分离血清后测定血清中谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、甘油三酯(triglyceride,TG)和总胆固醇(total cholesterol,TC)的含量。3、取血后的小鼠断颈处死,分离肝脏,取部分肝组织石蜡包埋,切片后分别进行HE染色、Masson染色和天狼猩红染色,以观察肝脏病理改变及胶原沉积情况;部分肝组织用OCT包埋,切片后进行油红O染色以评价肝组织内脂质含量;再有部分肝组织经戊二醛固定,制备电镜样品,以观察肝细胞超微结构的改变。4、提取肝组织总DNA,利用Real-time PCR方法分析线粒体DNA(mt DNA)占细胞总DNA的相对值。5、提取肝组织总RNA,反转录后采用Real-time PCR方法检测HSS,PGC-1α,TFAM,ATPs,COXIV,Drp1,Fis1,Mfn1,Mfn2,Atg7等基因在两组小鼠肝组织内的表达情况。6、提取肝组织总蛋白质,利用Western blot方法进一步分析上述基因在蛋白质水平的表达变化,以验证Real-time PCR的结果。7、利用试剂盒分别检测肝组织内丙二醛(malondialdehyde,MDA)和ATP的含量。8、分离肝组织的线粒体,分析呼吸链复合物V和细胞色素C氧化酶活性,并检测线粒体膜电位的改变。实验结果:1、Real-time PCR及Western blot结果显示,Gfer+/-小鼠肝组织中HSS的表达量,无论在m RNA水平,还是蛋白质水平,均明显低于Gfer+/+组,说明我们繁育的Gfer+/-小鼠基因型鉴定正确可用于后续实验中。2、NASH造模4 w和8 w时,Gfer+/+和Gfer+/-小鼠血清中的ALT,AST,ALB和TG的含量无明显差异,但Gfer+/-小鼠血清中TC含量明显低于Gfer+/+小鼠,提示肝功能出现损害,脂质代谢出现紊乱。3、HE染色、油红O染色和Masson染色结果显示,造模4 w时,Gfer+/-小鼠肝组织内脂肪沉积及炎症较Gfer+/+小鼠更为严重。造模8 w时,虽然Gfer+/-小鼠肝组织内脂肪沉积轻于Gfer+/+小鼠,但炎症及胶原沉积明显重于Gfer+/+小鼠,提示:肝组织病变向纤维化阶段进展。4、电镜下观察肝细胞的超微结构,发现造模4 w和8 w时,Gfer+/-小鼠肝细胞内线粒体数目明显多于Gfer+/+小鼠,而且线粒体的面积增大,形状趋向椭圆。5、Real-time PCR及Western blot结果显示,造模4 w和8 w时,Gfer+/-小鼠肝组织内线粒体融合相关基因(例如Mfn1和Mfn2)的表达明显低于Gfer+/+小鼠,与自噬相关的Atg7的表达同样明显低于Gfer+/+小鼠,提示线粒体动态(mitochondrial dynamics)发生改变,融合出现障碍。6、Real-time PCR结果显示,造模4 w和8 w时,Gfer+/-小鼠肝组织内mt DNA与n DNA的相对含量明显低于Gfer+/+小鼠;与mt DNA复制、转录相关的PGC-1α和TFAM的表达同样明显低于Gfer+/+小鼠;由mt DNA转录并翻译的ATP合酶(ATPs)和细胞色素c氧化酶IV(Cox-IV)的表达也随之降低;与之对应,Gfer+/-小鼠肝组织内呼吸链复合物V和细胞色素C氧化酶活性减弱,线粒体膜电位降低。7、Gfer+/-小鼠肝组织内ATP的含量明显低于Gfer+/+小鼠,而MDA的含量明显高于Gfer+/+小鼠。结论:1、本实验室制备并繁殖的Gfer+/-小鼠,其组织内HSS含量稳定降低,可应用于疾病模型的构建以研究HSS的功能。2、HSS表达下降,抑制线粒体融合,使线粒体生物生成出现障碍,造成线粒体呼吸链功能异常,脂肪酸氧化受到抑制,从而加重NASH的病程。


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