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FOXO3在氯化锰致SH-SY5Y神经细胞线粒体自噬中的作用

宋冬梅  
【摘要】:锰广泛应用于工业生产中如采矿业、金属冶炼、焊接等领域;同时由于含锰防爆剂甲基环戊二烯三羰基锰(Methylcyclopentadienyl manganese tricarbonyl,MMT)代替四乙基铅广泛使用,造成环境中过量锰暴露,对人体健康造成危害。锰化合物颗粒主要通过呼吸道进入人体,极易分布在富含线粒体的组织。脑排出速率较其它器官慢,吸收过量的锰化合物主要引起中枢神经系统病变,表现为帕金森样症状。线粒体是为机体提供能量的主要场所,锰对线粒体有特殊亲和力,可通过阻断线粒体能量转换、增加自由基产量影响线粒体功能,阻碍细胞呼吸,导致线粒体膜电位降低,活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生增加,线粒体损伤。随着对帕金森疾病研究的不断深入,已有研究证明线粒体损伤是锰引起帕金森疾病的重要机制之一。线粒体自噬作为线粒体质量控制的首要过程,参与MnCl_2致SH-SY5Y神经细胞自噬。有文献报道,转录因子FOXO3调控线粒体自噬相关蛋白表达,但其是否参与MnCl_2致SH-SY5Y神经细胞线粒体自噬过程及其可能的调控机制尚不清楚。本研究利用MnCl_2染毒具有多巴胺能神经元特性的细胞系神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y),确定MnCl_2最适染毒剂量,在250μM MnCl_2染毒下观察不同时间的线粒体自噬发生情况;并通过检测线粒体功能指标如线粒体膜电位、线粒体内ROS产量;通过慢病毒si RNA沉默FOXO3基因(si FOXO3)实现FOXO3低表达,探讨FOXO3在线粒体自噬发生中的分子机制。1.MnCl_2致SH-SY5Y细胞毒性的剂量效应关系将SH-SY5Y神经细胞分别暴露于250、500、1000μM MnCl_2染毒24 h,通过MTT法检测MnCl_2对细胞的毒性作用。结果表明,随着染毒浓度的增加,细胞存活率呈明显的下降趋势。于250μM MnCl_2处细胞存活率为84.3%±2.2%。各染毒组细胞存活率与对照组相比差别均具有统计学差异(P0.05)。2.MnCl_2对SH-SY5Y细胞毒性的时间效应关系将SH-SY5Y神经细胞暴露于250μM MnCl_2分别染毒2、4、6、8、12、24 h,通过MTT法检测MnCl_2对细胞的时间毒性作用。结果表明,随着染毒时间的增加,细胞存活率呈下降趋势。6 h处细胞存活率为82±3%,12 h细胞存活率80%,实验组(除2 h外)细胞存活率与对照组相比差别均具有统计学差异(P0.05)。3.MnCl_2致SH-SY5Y细胞线粒体自噬线粒体自噬是清除受损线粒体的有效途径之一,本实验通过TEM、激光共聚焦线粒体和溶酶体共定位及蛋白印记检测线粒体自噬相关蛋白。结果可见自噬溶酶体内高密度的电子颗粒溶解物。提示低浓度MnCl_2激发SH-SY5Y神经细胞发生自噬。进一步验证是否发生线粒体自噬,分别用Mitotracker Green和Lysotracker Red标记线粒体和溶酶体结果发生重叠,呈明显时间依赖效应。自噬标志性蛋白LC3发生明显的LC3-Ι向LC3-II转变。Beclin-1在4 h处表达量达到最大,6 h处有所降低。p62蛋白作为自噬降解底物随着时间的增加表达量逐渐减少。4.MnCl_2致SH-SY5Y细胞线粒体损伤将SH-SY5Y神经细胞暴露于250μM MnCl_2分别染毒2、4、6 h,运用流式细胞术的方法,利用激光共聚焦、Image J软件观察、分析。结果显示,线粒体膜电位随着染毒时间的增加逐渐降低,线粒体受损。利用Mito SOX标记线粒体内活性氧产量,结果显示线粒体内活性氧聚集,并呈明显的时间依赖效应。表明过量MnCl_2可引起SH-SY5Y神经细胞线粒体的损伤。5.FOXO3在MnCl_2致SH-SY5Y细胞线粒体自噬中的表达SH-SY5Y神经细胞暴露于250μM MnCl_2分别染毒2、4、6 h,利用蛋白印迹法对线粒体相关蛋白进行检测。结果显示,LC3-II/LC3-I、Beclin-1、PINK1蛋白在NC+Mn组暴露于250μM MnCl_2作用6 h后,表达明显上升(P0.05)。同时,si FOXO3+Mn组暴露于250μM MnCl_2作用6 h后其表达明显低于NC+Mn组,与共聚焦结果一致。说明FOXO3低表达对线粒体自噬起抑制作用。6.FOXO3在MnCl_2致SH-SY5Y细胞线粒体自噬中的核滞留将SH-SY5Y神经细胞暴露于250μM MnCl_2分别染毒2、4、6 h,蛋白印迹法分别对细胞核、细胞质中FOXO3蛋白进行检测。核中FOXO3与对照组相比表达在6 h处达到峰值。相反,细胞质表达量随时间增加逐渐降低。表明MnCl_2在诱导自噬的过程中促进FOXO3核滞留。提示在MnCl_2致SH-SY5Y神经细胞线粒体自噬过程中细胞核FOXO3参与并起重要作用。此外,线粒体自噬标志性蛋白PINK1、P-parkin表达量随时间的增长逐渐增加,并呈明显时间依赖关系。可能与其受核内FOXO3调控表达上升促进自噬发生有关。综上,本研究揭示了细胞核内FOXO3在MnCl_2致SH-SY5Y神经细胞线粒体自噬中的作用并阐明了其可能存在的调控机制。MnCl_2可诱导细胞线粒体自噬水平增加,FOXO3可通过对自噬相关蛋白LC3、Beclin-1、PINK1、P-parkin的调控对线粒体自噬起促进作用。


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