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清开灵注射液中多肽含量的快速测定及杂质蛋白的限量检查

周冠月  
【摘要】:清开灵注射液是北京中医药大学在“安宫牛黄丸”的基础上研制而成的现代中药制剂,,是经典名方二次开发的典范。其主要成分为胆酸、猪去氧胆酸、水牛角、珍珠母、黄芩苷、栀子、板兰根、金银花组成,具有清热解毒、化痰通络、醒神开窍功效。临床主要用于治疗热病神昏、中风偏瘫、急慢性肝炎、乙型肝炎、上呼吸道感染、肺炎、脑血管等病症,在治疗急重热症中发挥不可替代的重要作用。 随着清开灵注射液在临床的应用日益广泛,不良反应报道数量也明显增多,特别是严重不良反应,使其受到前所未有的挑战。清开灵注射液不良反应产生的原因复杂,产品本身存在蛋白质等杂质或有效成分氧化降解等是重要原因之一 本论文围绕清开灵注射液中的大分子物质展开研究,针对清开灵注射液中的多肽类有效成分建立了快速的含量测定方法,针对清开灵注射液中的大分子物质建立了系统的分离方法,并对大分子物质中的杂质蛋白部分建立了限量检查的方法,完善了清开灵注射液的质量标准,对提高清开灵注射液的生产质量控制水平起到了重要意义。 论文主要研究内容及结果如下: 1、Bradford法结合超滤离心法测定中药注射液中蛋白及总肽的含量 以清开灵注射液为样品,首先采用超滤离心法将注射剂中蛋白及多肽类物质与小分子物质分离并浓缩,紧接着采用考马斯亮蓝显色法对浓缩所得样品中的蛋白及多肽类物质进行定量测定,并对所建立的含量测定方法进行了方法学考察。实验中根据分子量的不同选取不同分子截留量的超滤离心管对注射液中蛋白及多肽分子量的分布范围-并进行了研究。 将建立的蛋白含量测定方法用于参麦、刺五加、茵栀黄、红花、丹参等十五种注射液中蛋白成分的限量检查,探索该方法在中药注射液中的适用性。 2、超滤所得大分子样品反相指纹图谱的探索性研究 在第一章实验中制得的清开灵注射液中蛋白及多肽类样品的基础上,采用AsahipakODP 504E色谱柱对样品进一步分析,考察清开灵注射液中多肽类有效成分在反相液相色谱柱上的指纹图谱。 3、交联葡聚糖凝胶柱对清开灵注射液中大分子物质分离方法的建立 在第二章实验内容证实超滤离心法所得的大分子样品中残留有其他小分子物质的基础上,采用葡聚糖凝胶过滤色谱除去清开灵注射液中的小分子物质,以得到清开灵注射液中的大分子物质样品。实验中分别对色谱柱、洗脱液、流速以及葡聚糖凝胶型号进行考察,建立清开灵注射液中大分子样品的最佳分离条件。 4、TSK色谱柱对清开灵注射液中蛋白类杂质的限量检查 在第三章实验建立了清开灵注射液中大分子物质的分离方法的基础上,采用TSK凝胶色谱柱对清开灵注射液中大分子样品进行再一次的分析,实验对各标准蛋白的分子量与保留时间进行线性考察,得到五种标准蛋白在TSK凝胶柱上的分子量标准曲线;并考察标准蛋白含量的线性关系,得到标准蛋白的质量标准曲线。在此基础上对清开灵注射液中杂质蛋白的分子量以及含量建立限量检查标准。 以上实验内容的研究结果表明: (1) Bradford法结合超滤离心法用于中药注射液中杂质蛋白的检查具有其实用性,但在具体运用中还存在很多限制条件,需要对其适用范围展开进一步的研究。 (2)葡聚糖凝胶色谱法结合TSK凝胶色谱法建立了清开灵注射液中杂质蛋白的限量检查方法。限量标准要求注射液中分子量大于10KD的杂质蛋白含量不得超过10ppm。将该方法运用于十批清开灵注射液的样品测定,结果表明,该方法稳定性好,重复性高,不受人员以及仪器变动的影响,结果可靠,限量标准的确定亦非常合理,可以作为药典中有关中药注射液相关物质检查的参考。


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