毒热平注射液对流感病毒性肺炎小鼠治疗作用机制的研究

【摘要】：流感病毒是呼吸道感染的重要病原体,在全世界范围内周期性流行,对人类生命和健康构成了严重的威胁。中医药临床防治具有独特效果,毒副作用小,药源丰富,价格低廉,改善临床症状快等优势,在治疗病毒感染性疾病上得到广泛的应用,已显示出了中医药的独特优势。因此,切实做好中医药抗流感的研究工作具有十分重要的意义。本实验从基因水平和细胞分子水平上探讨毒热平注射液对流感病毒性肺炎小鼠的作用机制,为毒热平注射液的临床应用提供理论依据。 目的： 研究由清热解毒药黄芩、栀子、胆酸、灯盏花配伍组成的毒热平注射液对流感病毒性肺炎小鼠肺组织细胞中AP-1基因和肺组织中MMP-1、MMP-9、TIMP-1三种细胞因子含量的影响作用,对流感病毒感染细胞介导炎症反应造成肺损伤的机制进行分析,为清热解毒中药制剂用于临床治疗流感病毒性肺炎提供理论依据。 方法： 1、毒热平注射液对流感病毒性肺炎小鼠肺指数及其肺脏病理变化的影响 将ICR小鼠随机分为六组：正常组、模型组、毒热平注射液小剂量组、毒热平注射液中剂量、毒热平注射液大剂量及利巴韦林组,每组11只,以1/3LD50的流感病毒液滴鼻感染小鼠造模,0.05mL／只,正常组以生理盐水滴鼻对照。造模后当日腹腔注射给药,每天1次,0.3m1/次；正常组和模型组小鼠注射生理盐水对照。5天后摘眼球处死小鼠,摘取肺脏,计算肺指数；制作切片光镜观察肺组织病理形态变化。 2、毒热平注射液对流感病毒性肺炎小鼠肺组织细胞中核因子AP-1基因表达的影响 动物分组、造模、给药方法同上。摘眼球处死小鼠,取新鲜肺组织冰上剪碎,把剪碎的组织样品移入EP管,立即投入液氮中保存。RT-PCR检测肺组织细胞中AP-1基因表达水平。 3、毒热平注射液对流感病毒性肺炎小鼠肺组织MMP-1、MMP-9和MMP-1含量的影响 动物分组、造模、给药方法同上。取小鼠肺组织,称重后移入玻璃匀浆器中,按照1：9质量比例加入冷的生理盐水,充分研磨使组织匀浆化。将制备好的匀浆以3000r/min的速度离心,提取其上清液,采用ELISA法(双抗体夹心法)检测MMP-1、MMP-9、TIMP-1表达含量。 结果： 1.毒热平注射液对流感病毒性肺炎小鼠肺指数及其肺脏病理变化的影响结果显示,FM1感染致小鼠流感病毒性肺炎后,模型组的肺指数显著高于正常组(p0.01)。与模型组比较,毒热平注射液治疗后各组肺指数均降低,对流感病毒所致小鼠肺组织炎性病变表现出明显的抑制作用,其中毒热平注射液中剂量组效果明显(抑制百分数为26.35%)。HE染色光镜观察,正常组小鼠肺组织形态结构完整。模型组小鼠可见大量炎性细胞浸润,正常的肺组织结构消失,弥漫性肺泡壁增厚。毒热平注射液治疗后肺部病变明显减轻。毒热平注射液各剂量组肺泡管、肺泡囊、肺泡等肺组织形态结构较为完整,偶见少量的炎性细胞浸润,各组间形态变化相差不大。 2.毒热平注射液对流感病毒性肺炎小鼠肺组织细胞中核因子AP-1基因表达的影响 结果显示,FMl感染致小鼠流感病毒性肺炎后,小鼠肺组织细胞中c-jun、c-fos基因表达升高；与模型组比较,毒热平注射液中小剂量组对FM1感染小鼠肺组织细胞中c-jun基因含量具有下调作用(P0.05)；毒热平注射液大中小各剂量组对FM1感染小鼠肺组织细胞中c-fos基因含量具有下调作用(P0.05)。 3.毒热平注射液对流感病毒性肺炎小鼠肺组织MMP-1、MMP-9和TIMP-1含量的影响 结果显示,FM1感染致小鼠流感病毒性肺炎后,小鼠肺组织中MMP-1含量升高,与正常组比较P0.05；MMP-9含量显著升高,与正常组比较差异极显著(P0.01)；而模型组肺组织中TIMP-1的含量与正常组相比无统计学差异(P0.05)。与模型组比较,毒热平注射液中小剂量组对FM1感染小鼠肺匀浆中MMP-9含量具有显著下调作用(P0.01)；毒热平注射液大中小各剂量组对FM1感染小鼠肺匀浆中MMP-1含量具有下调作用,对TIMP-1含量具有显著上调作用(P0.01)。 结论： 1.FM1感染致小鼠流感病毒性肺炎小鼠后,肺组织出现明显的病理损伤,肺指数明显升高；毒热平注射液可明显减轻肺组织炎性损伤,降低肺指数,对FM1感染小鼠肺脏具有保护作用。 2.FM1感染致小鼠流感病毒性肺炎后对肺组织细胞中AP-1基因的表达具有促进作用,而毒热平注射液可下调AP-1基因的表达水平以减轻炎症介质的释放。 3.毒热平注射液可通过降低流感病毒性肺炎小鼠肺组织中MMP-1和MMP-9含量、升高TIMP-1含量以减轻肺组织的炎性损伤。