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清开灵注射液对大鼠缺血性脑损伤时巨噬细胞趋化因子-1β的作用机制研究

闫杨杨  
【摘要】:缺血性脑血管病包括短暂性脑缺血发作、脑血栓形成和脑栓塞等,是临床常见病、多发病,其病死率和致残率高,严重威胁人类的健康,是医学领域的重要研究课题之一。缺血性中风病属中医“络病”范畴,“毒损脑络”是其病机关键。络病学基础研究发现,脑血管内皮细胞损伤在脑络损伤的多个病理环节中发挥着重要作用,其中由脑微血管内皮细胞产生的巨噬细胞趋化因子-1β(Macrophages chemotactic factors-1 beta,MIP-1β)通过旁分泌或自分泌的方式对脑微环境发挥着重要影响。本研究是在中医络病理论的指导下,以脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells,BMEC)为切入点,在体实验研究缺血性脑损伤过程中由BMEC分泌的MIP-1β的变化特征以及清开灵注射液(Qingkailing injection,QKL)通过MIP-1β环节发挥脑保护作用的机制。探讨中医药通过解毒通络、调和营卫,从而维持缺血性损伤神经元生存环境的稳定,发挥神经元保护作用的机制,以充实清开灵“解毒通络”的现代生物学依据,为治疗缺血性脑血管病的中药复方研究提供方法学的参考。 目的: (1)明确脑缺血损伤急性期时炎症趋化因子MIP-1β的动态表达规律; (2)明确QKL对大鼠脑缺血损伤24h脑内炎症趋化因子MIP-1β表达的影响; (3)明确MIP-1β受体CCR5的表达及小胶质细胞(microglia, MG)活化情况进而探讨QKL通过MIP-1β环节发挥脑保护作用的机制; 方法: (1)用2,3,5氯化三苯四唑(2,3,5-trephenyltetrazolium chloride,TTC)染色法观察线栓法大鼠永久性大脑中动脉栓塞脑缺血模型(Permanent middle cerebral artery occlusion,PMCAO)急性期6h、12h、24h、72h各时间点脑梗死体积的变化。用酶联免疫吸附法测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)观察大鼠脑缺血损伤急性期6h、12h、24h、72h各时间点MIP-1β在血清、脑脊液((?)cerebrospinal fluid,CSF)中的动态变化规律; (2) ELISA法测定大鼠PMCAO造模24h正常组(N组)、假手术组(S组)、模型组(M组)和QKL治疗组(T组)血清、CSF和脑匀浆内MIP-1β的表达情况;用冰冻切片免疫组织化学染色法(immunohistochemistry, IHC)观察各组脑组织中的MIP-1β的表达情况,进行半定量分析;用TTC法观察各组大鼠脑梗死体积;用苏木素伊红(hektoen enteric, HE)染色法对各组脑组织石蜡切片染色。参照Bederson法对大鼠PMCAO评分法对造模后的大鼠进行神经功能评分。 (3)用石蜡切片IHC染色法观察大鼠PMCAO (?)造模24hN组、S组、M组和T组各组脑组织中MIP-1β的唯一受体C Chemokine receptor 5(CCR5)和活化MG特异性标志物CD11b的表达情况;用透射电镜观察各组大鼠脑组织MG的超微结构变化。 结果: (1)TTC染色结果发现:模型组大鼠脑组织在6h、12h、24h、72h各时间点患侧脑组织均出现不同程度的梗死灶。其中脑缺血24h脑梗死体积明显大于6h、12h、72h组,有统计学意义(P0.05, P0.01, P0.01)。ELISA法检测结果发现:局灶性脑梗死6h、12h、24h、72h各时间点血清和CSF中模型组MIP-1β含量均高于正常组。其中,血清中MIP-1β在12h达到高峰,与正常组相比有统计学差异(P0.05);CSF中MIP-1β在6h已经高水平表达并在72h内持续高表达,与正常组相比有统计学差异(P0.05)。另外,发现模型组血清中MIP-1β的含量在各时间点略高于模型组CSF中的表达。我们发现MIP-1β在造模后血清和CSF中表达时间较早,提示我们在脑缺血发病的早期MIP-1β就开始参与相应的调节作用。 (2)用ELISA(?)法检测大鼠局灶性脑梗死24h各组血清、CSF和患侧(左侧)脑匀浆中MIP-1β含量,结果发现:血清中模型组与正常组相比MIP-1p表达明显升高(P0.01)。QKL干预后MIP-1β表达量与模型组相比有升高趋势,但无统计学意义;在CSF中模型组与正常组相比MIP-1β含量升高,有统计学差异(P0.01),QKL干预后MIP-1β表达量与模型组相比无统计学差异;在脑组织匀浆中模型组与正常组相比MIP-1β含量有升高的趋势,但没有统计学差异;而QKL治疗组与模型组相比显著升高,有统计学差异(P0.01);用IHC法半定量分析各组MIP-1β在脑组织中表达量与ELISA法检测MIP-1β在脑匀浆中各组表达具有一致性。TIC法染色结显示:大鼠模型组和QKL治疗组患侧(左侧)脑组织均出现不同程度的梗死灶,分布在大鼠中动脉输布的脑前2/3区域。QKL治疗后能有效缩小脑组织局部梗死灶体积(P0.01);神经功能评分结果显示QKL能有效改善大鼠脑栓塞后出现的神经功能障碍。用HE法光镜观察各组脑组织染色。上面这些结果提示我们,QKL可以缩小缺血性脑损伤24h脑梗死体积,有效恢复脑梗死后的神经功能障碍,显著改善神经细胞的状态、减轻脑水肿。同时QKL能促使MIP-1β在脑缺血24h的进一步表达。 (3)用IHC法半定量分析大鼠局灶性脑梗死24h各组脑组织CCR5和CD11b的表达,结果发现:模型组患侧脑梗死周围组织CCR5的表达与正常组相比显著增加(P0.01)。给予QKL注射液干预后,其表达与模型组相比显著性降低(P0.01)。模型组患侧脑梗死周围组织CD11b的表达与正常组相比显著增加(P0.01)。给予QKL注射液干预后,其表达与模型组相比显著降低(P0.01)。大鼠脑缺血24h脑组织患侧脑梗死周围CCR5与CD11b在各组表达趋势一致。 结论: (1)缺血性脑损伤后趋化因子MIP-1β在脑内表达增多,对维持脑微环境和趋化炎症细胞方面有重要意义。 (2) QKL可能是通过减少MIP-1β受体CCR5的表达,抑制小胶质细胞过度激活,减轻炎症反应损伤来发挥脑保护作用的。


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