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针刺与帕罗西汀对抑郁状态神经元保护机制的差异性研究

梁佳  
【摘要】:抑郁症是现代社会中发病率剧增的高危害性、高致残率的精神疾患。显著而持久的心境低落是抑郁症的主要特征,临床表现有情绪低落、兴趣减少、精神运动迟滞、言语减少、且常伴有自责自罪感,严重会导致自杀。随着来自社会环境中应激因素的不断加剧,抑郁症的发病率逐年上升。全球大型流行病学调查发现,抑郁症在世界致残性疾病中排名第四,终身患病率在3%-5%之间,预计到2020年其排名将仅次于缺血性心脏病,而跃至第二。抑郁症所致伤残居多数疾病之前,严重危害人类身心健康,给社会造成巨大负担。 目前抑郁症主要采用的是药物治疗。由于抑郁症的发病机制复杂,单靶点的治疗虽获肯定疗效,但仍无法摆脱毒副作用和患者依从性差等问题。针刺对机体具有整体的调节作用。抑郁症是针刺治疗的优势病种之一,临床疗效确切,获得广泛关注和认同。其在改善抑郁症患者躯体化症候群、认知障碍症候群和生活质量等方面,表现出疗效持续、全面且无副作用的特点。近年来,对针刺抗抑郁治疗的机制研究不断深入,发现针刺治疗是多靶点、多方面的整体治疗,在维持脑神经元细胞生存方面有一定的保护作用。 因此,本实验研究选取与细胞生存与凋亡关系最为密切的细胞内Ras-MEK-ERK及Ras-MKK-JNK信号转导通路,意在分子生物学水平上,探索针刺对神经元细胞生存质量的影响作用。选择孤养结合慢性应激抑郁模型大鼠为实验对象,模拟人类抑郁发病过程;采用手针、电针“百会”、“印堂”、“内关”穴、帕罗西汀灌胃三种干预措施治疗;观察抑郁模型大鼠行为学、单胺类神经递质表达的变化,以确定模型的成立;研究针刺在生理状态与病理状态下对细胞内ERK及JNK信号转导通路影响异同,针刺和药物治疗对影响细胞生存与凋亡的细胞内ERK及JNK信号转导通路影响异同;探索针刺抗抑郁治疗的作用机制,补充针刺抗抑郁机制的研究内容。 研究方法与结果: 1.建立孤养结合慢性应激抑郁大鼠模型,进行体重、旷场、糖水实验评价模型大鼠行为学改变情况。实验前各组大鼠行为表现均无统计学差异。实验结束后,模型组大鼠体重、糖水消耗量减少,均与空白组大鼠有显著性差异(P0.01);而旷场实验水平穿越格数与竖立次数显著低于空白组大鼠(P0.05)。手针、电针、帕罗西汀组大鼠体重均高于模型组,差异显著(P0.01);手针、电针、帕罗西汀组大鼠糖水摄入量均高于模型组,其中帕罗西汀组与模型组相比差异显著(P0.05);手针、电针治疗组大鼠旷场实验水平穿越格数增加,与模型组相比,手针组差异显著(P0.01);手针、电针、帕罗西汀组大鼠旷场实验竖立次数较模型组均有增加,与模型组相比,手针、电针组差异显著(P0.01),帕罗西汀组差异显著(P0.05)。空白+手针组大鼠行为学表现与空白组大鼠无统计学差异。 2.采用酶联免疫吸附法(ELISA)方法检测大鼠血清中单胺类神经递质(5-HT\NE\DA)含量,检测孤养结合慢性应激抑郁模型大鼠单胺类神经递质改变情况以及干预方式对其的治疗作用。结果如下:①大鼠血清5-HT含量,与空白组相比,模型组、模型+手针组、模型+电针组及模型+帕罗西汀组均下降,差异显著(P0.05);与模型组相比,模型+手针组、模型+电针组及模型+帕罗西汀组均上升,差异显著(P0.05);三组治疗组之间差别无统计学意义。②大鼠血清DA含量,与空白组相比,模型组大鼠下降,差异显著(P0.05);与模型组相比,模型+手针组、模型+电针组及模型+帕罗西汀组含量均增加,差异显著(P0.05);三组治疗组之间差别无统计学意义。③大鼠血清NE含量:与空白组相比,模型组、模型+手针组、模型+电针组及模型+帕罗西汀组大鼠血清NE含量减少,差异显著(P0.05);与模型组相比,模型+手针组、模型+电针组及模型+帕罗西汀组均增加,差异显著(P0.05);三组治疗组之间差异无统计学意义。空白+手针组大鼠血清单胺类神经递质含量与空白组大鼠无统计学差异。 3.研究ERK信号转导通路关键指标ERK1/2及其磷酸化水平与抑郁症发病及针刺抗抑郁治疗作用机制的关系。采用免疫印迹法(Western blot)检测,海马及前额叶皮层相关蛋白表达量及其磷酸化水平。结果如下:①抑郁模型大鼠海马及前额叶皮层ERK1表达水平与空白组无统计学差异;海马ERK2表达增加与空白组有显著性差异(P0.01),前额叶皮层ERK2表达水平与空白组无统计学差异。②与空白组相比,抑郁模型大鼠海马及前额叶皮层p-ERK1表达显著减少(P0.01)。与模型组比较,三组治疗组大鼠海马区p-ERK1表达量均上调,模型+手针组、模型+电针组差异显著(P0.01),模型+帕罗西汀差异显著(P0.05);模型+手针组与模型+帕罗西汀组相比差异显著(P0.01),模型+电针组与模型+帕罗西汀组相比差异显著(P0.05)。与模型组比较,模型+手针组、模型+电针组大鼠前额叶皮层p-ERK1表达显著增加,差异显著(P0.01);与模型+帕罗西汀组相比,模型+手针组、模型+电针组前额叶皮层p-ERK1表达有显著差异(P0.01)。③与空白组相比,抑郁模型大鼠海马及前额叶皮层P-ERK2表达显著减少(P0.01)。与模型组比较,模型+手针组、模型+电针组及模型+帕罗西汀组大鼠海马区p-ERK2表达上调,差异显著(P0.01);三组治疗组织间无差异。与模型组比较,模型+手针组、模型+电针组及模型+帕罗西汀组大鼠前额叶皮层p-ERK2表达均上调,模型+手针组、模型+电针组上调差异显著(P0.01),模型+帕罗西汀组上调差异显著(P0.05);与模型+帕罗西汀组,模型+手针组、模型+电针组差异显著(P0.01)。空白十手针组与空白组大鼠海马及前额叶皮层ERK1/2磷酸化水平无统计学差异。 4.对细胞内信号转导通路交汇点CREB (cAMP反应元件结合蛋白)的研究。采用免疫印迹法(Western blot)检测,海马及前额叶皮层CREB蛋白表达量及其磷酸化水平。结果如下:①模型组大鼠海马区CREB表达比空白组减少,差异显著(P0.05),皮层CREB表达与空白组无统计学差异。②模型组大鼠海马区及前额叶皮层p-CREB表达减少,与空白组比较差异极显著(P0.01);海马区,三组治疗组p-CREB表达较模型组上升,差异极显著(P0.01),且模型+电针组、模型+帕罗西汀组显著高于模型+手针组(P0.05,P0.01)。空白+手针组与空白组大鼠海马及前额叶皮层CREB表达及其磷酸化水平方面无统计学差异。 5.对ERK信号转导通路下游BDNF(脑源性神经营养因子)的研究。采用免疫印迹法(Western blot)检测,海马及前额叶皮层BDNF蛋白表达量。结果如下:与空白组相比,抑郁模型大鼠海马及前额叶皮层BDNF表达显著减少(P0.01)。大鼠海马区BDNF蛋白表达显示:与模型组比较,模型+手针组、模型+电针组差异显著(P0.01),模型+帕罗西汀组差异显著(P0.05)。模型+手针组与模型+帕罗西汀组差异显著(P0.01),模型+手针组与模型+电针组相比差异显著(P0.01),模型+电针组与模型+帕罗西汀组相比差异显著(P0.05)。大鼠前额叶皮层BDNF蛋白表达显示:与模型组比较,模型+手针组、模型+电针组及模型+帕罗西汀组差异显著(P0.01);模型+手针组与模型+帕罗西汀组差异显著(P0.01),模型+手针组与模型+电针组差异显著(P0.01),模型+电针组与模型+帕罗西汀组之间无统计学差异。空白+手针组与空白组大鼠海马及前额叶皮层BDNF蛋白表达无统计学差异。 6.抑郁模型大鼠海马及前额叶皮层神经元凋亡因子存在情况及干预措施对其改变情况。采用免疫印迹法(Western blot)检测,海马及前额叶皮层促凋亡因子BAD与抗凋亡因子Bcl-2蛋白表达量,并计算其比值,探讨细胞死亡与存活程度。结果发现,①大鼠海马区BAD/Bcl-2比值:与空白组相比,模型组大鼠海马区BAD/Bcl-2比值显著增加(P0.05);与模型组比较,模型+手针组、模型+电针组及模型+帕罗西汀组大鼠海马区BAD/Bcl-2比值显著下降(P0.05);三组治疗组之间无统计学差异。②大鼠前额叶皮层BAD/Bcl-2比值:与空白组相比,模型组大鼠前额叶皮层BAD/Bcl-2比值极显著增加(P0.01);与模型组比较,模型+手针组、模型+电针组及模型+帕罗西汀组大鼠前额叶皮层BAD/Bcl-2比值下降,其中模型+手针组及模型+帕罗西汀组与模型组比较差异极显著(P0.01);三组治疗组之间无统计学差异。空白+手针组与空白组大鼠在海马及前额叶皮层BAD/Bcl-2比值上没有统计学差异。 7.研究JNK信号转导通路相关指标NK、p-JNK、c-Jun、Caspase-3)与抑郁症发病及针刺抗抑郁治疗作用机制的关系。采用免疫印迹法(Western blot)检测,海马区蛋白表达量及磷酸化水平。结果如下:①抑郁模型大鼠海马区JNK蛋白表达水平与空白组无统计学差异。②抑郁模型大鼠海马区p-JNK蛋白表达水平与空白组差异显著(P0.01);与模型组相比,模型+手针组大鼠海马p-JNK蛋白含量下降,差异显著(P0.05)。③抑郁模型大鼠海马c-Jun蛋白表达量增加,与空白组差异显著(P0.01);各治疗组与模型组无统计学差异。④抑郁模型大鼠海马Caspase-3蛋白表达显著增加(P0.01);三种治疗方式均能下调海马Caspase-3蛋白表达水平,与模型组相比差异显著(P0.01),且两组针刺治疗组效果好于帕罗西汀组,差异显著(P0.01)。空白+手针组与空白组大鼠,海马区JNK、p-JNK、c-Jun表达无统计学差异。空白+手针组与空白组大鼠,海马区Caspase-3蛋白表达水平,差异显著(P0.05);空白+手针组与模型组相比海马区Caspase-3蛋白表达水平,差异显著(P0.01)。 结论 1.孤养结合慢性应激刺激大鼠模型,能够模拟人类抑郁症状。造模成功后,模型大鼠体重下降、兴趣减低、探究行为减少,血清单胺类神经递质(5-HT\NE\DA)降低,Ras-MAPK/ERK通路多环节受到抑制,Ras-MKK-JNK通路被激活,神经元细胞内BAD/Bcl-2 (?)(?)值升高,神经元凋亡超过正常水平。 2.研究结果显示,生理状态下,针刺对抑郁模型大鼠行为学、血清单胺类神经递质、ERK及JNK磷酸化水平均无影响。推测,正常机体状态下,针刺可能不会产生导致其正常状态发生改变的作用。 3三种干预方式均能改善抑郁模型大鼠的行为学表现,且研究结果显示,针刺对探究行为的改善作用优于帕罗西汀,帕罗西汀对中枢奖赏机制的改善作用优于针刺。 4.三种干预方式均可以逆转模型大鼠血清单胺耗竭状态,三者之间无统计学差异。 5.与帕罗西汀相比,针刺能显著改善ERK1/2蛋白激酶磷酸化水平,激发Ras-MAPK/ERK通路,扩大BDNF蛋白表达,从而发挥神经元保护作用。 6.与帕罗西汀相比,针刺能显著调整JNK蛋白激酶磷酸化水平,抑制Ras-MKK-JNK通路,减少caspase-3蛋白表达,发挥抗神经元凋亡作用。 7.针刺与帕罗西汀均可改善模型大鼠神经元细胞内BAD/Bcl-2比值,达到神经元保护作用。 8.研究结果显示,病理状态下,针刺与帕罗西汀对MAPK信号通路磷酸化水平(p-ERK1/2、p-JNK)的调节作用有显著差异,导致细胞最终效应蛋白(BDNF、caspase-3)扩大作用有显著差距。 9.推测,针刺抗抑郁治疗,临床表现出起效时间早、减毒增效作用强、改善患者整体状态显著,可能与上述信号转导机制的差异性呈正相关。


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