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雄黄纳米微粒在细胞水平抑制

程淼  
【摘要】:呼吸道合胞病毒和腺病毒是儿童呼吸道感染的常见病原,这两种病毒具有致病力强,发病率高的特点,常因院内感染引起爆发流行,目前仍缺乏对呼吸道合胞病毒和腺病毒治疗较好的药物。国内外有关于雄黄治疗病毒性疾病的临床报道,尚无雄黄抗病毒的实验研究。本实验选择非阶段性的单链负股RNA病毒-呼吸道合胞病毒(respiratoy syncytialvirus,RSV)和属于双链DNA病毒-腺病毒(Adenovirus,ADV)为研究对象,观察雄黄纳米微粒抗人3型腺病毒(Human Adenovirus-3, HAdV-3)和RSV的作用。同时由于在HAdV-3感染早期,病毒为了最大限度地增殖与传播,抑制感染细胞凋亡,以保证自己能够在细胞凋亡前产生足够数量的子代病毒以及逃避宿主的免疫监视系统。本研究在腺病毒感染早期,通过观察雄黄纳米微粒对PI3-K (phosphatidylinositol3-kinase,磷脂酰肌醇3-激酶)/AKT (v-akt murine thymoma viral oncogene homolog)通路的抑制作用,诱导腺病毒感染细胞凋亡,来探讨雄黄抗病毒的作用机制,揭示雄黄纳米微粒抗腺病毒分子靶点。 目的 1通过体外实验建立RSV和HAdV-3感染Hep-2的细胞模型,观察雄黄纳米微粒对细胞病变(Cytopathic effect, CPE)的抑制作用,并采用荧光定量RT-PCR和PCR的方法检测雄黄对RSV和HAdV-3病毒基因表达的影响,探讨雄黄纳米微粒抑制RSV和HAdV-3核酸复制的作用。 2研究雄黄纳米微粒在腺病毒感染早期诱导病毒感染细胞凋亡的机制。通过激光共聚焦显微镜观察雄黄纳米微粒干预腺病毒感染早期细胞凋亡情况。采用western-blot法观察雄黄纳米微粒对腺病毒感染Hep-2细胞的AKT、p-AKT、NF-κB p65蛋白表达的影响,同时采用RT-PCR法检测雄黄纳米微粒对腺病毒感染Hep-2细胞凋亡蛋白Fas L、Bc1-2、bax及p53mRNA基因表达的影响,探讨雄黄纳米微粒抑制PI3-K通路诱导腺病毒感染细胞凋亡而起到抗病毒的作用。 方法 1雄黄纳米微粒对腺病毒及呼吸道合胞病毒复制的影响:采用CPE抑制实验,通过预防给药、治疗给药及直接灭活给药三种方式,在细胞水平上观察雄黄纳米微粒对腺病毒和呼吸道合胞病毒感染Hep-2细胞病变的抑制作用;采用荧光定量PCR和荧光定量RT-PCR的方法观察雄黄纳米微粒对腺病毒和呼吸道合胞病毒基因表达的影响,探讨雄黄纳米微粒抗DNA病毒和RNA病毒的作用。 2观察雄黄纳米微粒对腺病毒感染Hep-2细胞活性的影响:分别在腺病毒感染Hep-2细胞的24h、48h、72h和120h时,采用MTT方法观察不同浓度雄黄纳米微粒对腺病毒感染Hep-2细胞A值的影响。 3雄黄纳米微粒对腺病毒感染Hep-2细胞凋亡的影响:采用Annexin V/PI双染法激光共聚焦显微镜观察雄黄纳米微粒大剂量组和小剂量组在腺病毒感染24h时诱导病毒感染早期细胞凋亡的情况。 4雄黄纳米微粒对腺病毒感染Hep-2细胞PI3-K通路的影响:采用western-blot的方法研究雄黄纳米微粒大剂量组和小剂量组在腺病毒感染24h时Hep-2细胞中AKT、 p-AKT、NF-κB p65蛋白表达的水平,探讨雄黄纳米微粒对PI3-K通路的影响。 5雄黄纳米微粒对腺病毒感染细胞凋亡调控蛋白FasL、P53、Bc1-2、Bax基因表达的影响:采用实时荧光定量RT-PCR的方法研究雄黄纳米微粒大剂量组和小剂量组,在腺病毒感染24h时细胞凋亡调控蛋白FasL、P53、Bc1-2、Bax mRNA的基因表达。 结果 1雄黄纳米微粒在预防、治疗及直接灭活三种给药方式下,均可减轻HAdV-3和RSV感染Hep-2细胞的CPE程度。其中,雄黄纳米微粒抗HAdV-3的半数有效浓度(IC50)分别为0.255μg/mL、0.142μg/mL、0.117μg/mL,治疗指数(TI)分别为2.55、4.57和5.55;雄黄纳米微粒抑制RSV感染Hep-2细胞病变的半数有效浓度(IC50)分别为0.20μg/mL、0.13μg/mL、0.16μ/mL,治疗指数(TI)分别为3.18、4.99和4.11。雄黄纳米微粒对HAdV-3和RSV感染Hep-2细胞CPE抑制作用均存在着量效关系。 2荧光定量PCR和RT-PCR检测雄黄纳米微粒对HAdV-3和RSV感染Hep-2细胞病毒复制量,结果显示Hep-2细胞对照组无扩增曲线,CT35,HAdV-3和RSV病原体检测均为阴性;雄黄纳米微粒(加腺病毒)组、利巴韦林(加腺病毒)组和腺病毒模型组扩增曲线的CT值分别为29.30±0.08、33.05±1.29、26.01±0.25,腺病毒病原体检测为阳性。与腺病毒组(66699932±23.85)相比,雄黄纳米微粒(加腺病毒)组的复制量(912435.44±16.57)和利巴韦林(加腺病毒)组的复制量(459124.84±12.82)均降低,具有显著性差异(P0.05)。雄黄纳米微粒(加呼吸道合胞病毒)组、利巴韦林组(加呼吸道合胞病毒)和呼吸道合胞病毒组扩增曲线的CT值分别为25.58±0.19、27.42±5.74、17.59±0.1,呼吸道合胞病毒病原体检测为阳性。与呼吸道合胞病毒组(70952000±46.14)相比,雄黄纳米微粒(加呼吸道合胞病毒)组的复制量(1123500±20.25)和利巴韦林(加呼吸道合胞病毒)组的复制量(426593.78±49.02)均降低,差异显著(PO.05)。 3通过MTT法和激光共聚焦显微镜观察雄黄纳米微粒诱导腺病毒感染Hep-2细胞凋亡,结果显示雄黄纳米微粒0.367μg/mL、0.184μg/mL、0.092μg/mL、0.046μg/mL剂量组在HAdV-3感染24h时可诱导HAdV-3感染Hep-2细胞凋亡,同时经激光共聚焦显微镜观察显示雄黄大剂量组的细胞凋亡较小剂量组更明显;当雄黄纳米微粒作用到48h时可减轻HAdV-3感染细胞病变,细胞存活率明显多于腺病毒对照组,其对腺病毒CPE的抑制作用可以持续至120h。 4雄黄纳米微粒可通过作用于PI3-K介导的信号通路,降低磷酸化AKT和NF-κB p65蛋白表达的水平,增加促凋亡蛋白P53、FasL、Bax mRNA表达,降低抑凋亡蛋白Bcl-2mRNA表达,说明雄黄纳米微粒可能在腺病毒感染早期诱导感染细胞凋亡,发挥抗病毒的作用。 结论 1本研究证实了雄黄纳米微粒具有抗腺病毒和呼吸道合胞病毒的作用,填补了雄黄抗病毒实验研究的空白; 2雄黄纳米微粒可在腺病毒感染早期通过抑制PI3-K通路,降低AKT的磷酸化,促染早期细胞凋亡,从而起到抑制腺病毒复制的作用。


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