粘附分子与UAP中医证候相关规律及黄芪多糖干预机理研究

【摘要】：目的 以统计学和数据挖掘方法,从冠心病不稳定性心绞痛患者临床信息中归纳证候类型和证候要素,并研究其与血清中粘附分子P-选择素,VCAM-1浓度变化的关系,从无监督的机器分析数据方法中,获得较客观的更深层次隐含关系。 通过对人心脏微血管内皮细胞(HCMEC)进行缺糖缺氧和复糖复氧造模,模拟心绞痛发作时缺血对血管内皮的损伤机制,研究黄芪多糖对内皮损伤时粘附分子(P-选择素,VCAM-1)表达的干预作用和对P38和NF-Kb通路的信号转导机制。 方法 1.运用Kohonen网络聚类方法,对265例不稳定性心绞痛(UAP)患者的临床症状聚类分析,获得不稳定性心绞痛(UAP)的临床常见证候分型；运用因子分析的方法对UAP的常见证候要素进行归纳总结；运用QUEST决策树算法,探索证候要素和粘附分子P-选择素,VCAM-1的内在联系。 2.通过免疫组化、免疫蛋白印迹和荧光实时定量PCR的方法,模拟冠心病心绞痛缺血发作时的病理机制,对HCMEC进行缺糖缺氧和复糖复氧处理,观察黄芪多糖干预缺血再灌注损伤模型HCMEC下P-选择素、VCAM-1的蛋白表达和mRNA转录水平变化,以及P38和NF-Kb的磷酸化活性水平。 结果 1.UAP证候分型：运用Kohonen网络聚类方法,UAP证候聚为9个证型,按构成比排列依次为心血瘀阻(20.99%)、气虚血瘀夹痰(14.89%)、阳虚血瘀(11.83%)、心气亏虚(11.45%)、气阴两虚(10.69%)、痰浊壅滞(10.69%)、气郁(滞)化火(热)(9.16%)、痰热壅滞(6.49%)、心阳亏虚(3.82%)。 2.UAP证候要素：采用因子分析方法分析UAP患者临床症状,得到具有中医理论意义的7个公因子(证候要素),按构成比排列依次为血瘀(47.33%),气虚(38.55%)、痰浊(27.10%)、热蕴(20.61%)、气滞(16.03%)、阴虚(15.27%)、阳虚(14.89%)；57种组合型证候要素中,≥10例有6型,10～≥5例有9型,5～≥3例有11型,2例有10型,1例有21型,其中血瘀(15.85%)、气虚(12.83%)、气虚血瘀(7.17%)型最多。 3.UAP证候类型与粘附分子关系：各组证候类型的P-selectin、VCAM-1浓度之间有统计学差异(P0.01), P-selectin浓度以气虚血瘀夹痰组血瘀组阳虚血瘀组痰浊或兼化热组气滞或兼化热组痰浊组气阴两虚组气虚阳虚；与气虚血瘀夹痰组比较,除血瘀组外的其他各组均有统计学差异(P0.05,P0.01),与气虚组比较,除气阴两虚、阳虚组外其他各组均有统计学差异(P0.05, P0.01)。VCAM-1浓度以气虚血瘀夹痰痰浊或兼化热血瘀组气滞或兼化热组阳虚血瘀痰浊组气阴两虚组气虚阳虚；与气虚血瘀夹痰组比较,除心血瘀阻、气郁(滞)化火(热)、痰热蕴结外的其他各组均有统计学差异(P0.05,P0.01),与气虚组比较,除心气亏虚、气阴两虚、痰浊阻滞外的其他各型均有统计学差异(P0.05,P0.01)。 UAP证候要素与粘附分子关系(QUEST算法)：气虚与低浓度P-selectin值有关,与VCAM-1的浓度关系不明显；瘀血与高浓度P-selectin值有关,与VCAM-1浓度有一定关系,但关系较复杂；痰浊与P-selectin的浓度关系不明显,与高浓度VCAM-1值有关；热蕴与一定范围较高浓度的VCAM-1有关,与P-selectin的浓度关系不明显；阳虚与低浓度P-selectin、VCAM-1值均有关；阴虚和气滞与P-selectin、VCAM-1的浓度关系不明显。即P-selectin在瘀血存在时呈高表达,气虚、阳虚时呈低表达；VCAM-1在瘀血、热蕴、痰浊存在时呈高表达,阳虚时呈低表达。 4.损伤模型粘附分子及P38和NF-κb基因转录水平和蛋白表达：模拟冠心病心绞痛缺血发作时的病理机制,对人心脏微血管内皮细胞(HCMEC)进行缺糖缺氧和复糖复氧处理后,P-selectin、VCAM-1蛋白表达和1nRNA转录水平比正常组明显增高(P0.05,P0.01),P-P38和其下游靶点ATF-2、NF-κb下游靶点iκb的mRNA基因转录水平比正常组明显增高(P0.01)。 5.黄芪多糖干预损伤后粘附分子及P38和NF-κb基因转录水平和蛋白表达：HCMEC的P-selectin、VCAM-1蛋白表达和mRNA转录水平较模型组比较明显下调(P0.05, P0.01), P-P38、ATF-2、iκb的mRNA基因转录水平较模型组有显著下降(P0.01),与NF-κb抑制剂PDTC和P38抑制剂SB203580比较无统计学差异(P0.05)。 结论 1.UAP证候类型以心血瘀阻和气虚血瘀夹痰型最为多见。 2.UAP证候要素为血瘀、气虚、痰浊、热蕴、气滞、阴虚、阳虚；以组合型证候要素居多,组合规律复杂多样,其中血瘀、气虚、气虚血瘀型最多。 3. P-selectin、VCAM-1在虚实夹杂和实证时表达较高,以气虚血瘀夹痰证最高,在虚证时表达偏低,以阳气亏虚的浓度最低。QUEST算法提示,P-selectin的浓度直接反映瘀血的程度,间接反映痰浊的程度；VCAM-1的浓度直接反映痰浊程度,间接反映瘀血、热蕴程度；热蕴对增加P-selectin、VCAM-1浓度起促进作用；气滞对P-selectin、VCAM-1浓度的影响小于痰、瘀对二者的影响。 4.正常HCMEC中P38和NF-κb活性受到相对抑制,使P-selectin、VCAM-1处于低表达、低转录水平,损伤后P38和NF-κb活性明显增强,使P-selectin、VCAM-1表达和转录明显增高,加重细胞损伤。 5.黄芪多糖能下调HCMEC的P-selectin、VCAM-1表达及转录,具有浓度依赖性；对P38和NF-κb活性起到一定的抑制作用,抑制效果与PDTC和SB203580比较无差异；对P38通路和NF-κb通路的信号转导有共同抑制作用,通过抑制两通路的活性,使依靠这两条通路转录基因和表达蛋白的粘附分子(P-selectin、VCAM-1)水平被有效降低,阻断粘附分子介导的内皮细胞和白细胞粘附后,白细胞释放大量细胞毒性介质对内皮的损伤。 本研究UAP者以血瘀、气虚多见,血清中sP-selectin、sVCAM-1虚证时偏低表达,虚实夹杂和实证时较高表达；经缺氧再灌注损伤造模后,高度表达的P-selectin、VCAM-1经黄芪多糖干预后浓度明显下降,推测以益气为主的黄芪,兼有活血的功效,在UAP的治疗中起到了非常重要的作用。