基于NO/cGMP通路的白芍养血柔肝作用及其分子机制的初步研究

【摘要】：本课题在明确了中药白芍具有养血柔肝作用、预实验证明芍药苷确切作用于NO/cGMP通路的前提下,通过研究白芍的主要有效成分芍药苷,来探讨基于NO/cGMP通路的白芍养血柔肝作用及其分子机制。实验采用辐射致血虚结合束缚应激动物模型来探讨血虚肝郁证模型的建模方法,从促进改善血象、调整HPA轴、改善脑内单胺类递质含量等方面揭示白芍的养血柔肝解郁作用特点；研究芍药苷对NO/cGMP信号通路关键物质NO和cGMP的影响,对该通路调控因素谷氨酸(Glu)及其受体、一氧化氮合酶(NOS)、鸟苷酸环化酶(sGC)和磷酸二酯酶(PDE)等靶点的影响,揭示了血虚肝郁状态下NO/cGMP信号通路的病理变化,探讨了芍药苷养血柔肝调控NO/cGMP信号通路的分子机制。 1白芍养血柔肝解郁药效学实验 1.1芍药苷的补血作用初步研究 1.1.1芍药苷对综合放血法致小鼠血虚模型的补血作用 目的：采用综合放血法制备小鼠血虚模型,研究芍药苷的补血作用。 方法：小鼠连续给药7天,然后造模两周。模型组以及芍药苷25mg/kg、50mg/kg和100mg/kg剂量组隔日由眼底静脉丛放血0.4m1,结合温水强迫游泳20min,同时饲料按75g/kg体重控制,自由饮水,持续14天,制成血虚证模型,造模期间仍继续给药,于第7、14天眼眶采血40u1,测定各组外周血白细胞、红细胞、血小板的数目以及血红蛋白含量。 结果：第7天,模型组较空白组白细胞数显著降低(P0.001),芍药苷100mg/kg剂量组与模型组相比可以显著提高白细胞数目,差异有统计学意义(P0.001)；第14天,芍药苷25mg/kg、50mg/kg和100mg/kg剂量组均可升高白细胞数目,与模型组比较有显著性差异(P0.05,P0.001,P0.001)。第7天和第14天,芍药苷各剂量组与模型组相比红细胞数目有所提高。 结论：芍药苷在一定程度上可以升高白细胞、红细胞数目,具有补血作用。 1.1.2芍药苷对放射线致小鼠血虚模型的补血作用 目的：采用Co60-γ射线照射法,制备小鼠血虚模型,研究芍药苷的补血作用。 方法：模型组小鼠以及芍药苷25mg/kg、50mg/kg和100mg/kg剂量组小鼠采用60Co-γ射线全身1次照射,照射剂量3.5Gy,制成血虚证模型。照射后小鼠立即灌胃,连续灌胃14d。各组小鼠造模后第3,7,14天,分别由尾静脉取血20μ1,检测外周血白细胞。 结果：其余各组白细胞数持续显著低于空白组,有显著性差异(P0.001)；第3天和第14天,芍药苷高剂量组较模型组白细胞数有所升高,差异有统计学意义(P0.01,P0.05)。 结论：给予高剂量芍药苷,可以在一定时间点升高该血虚模型小鼠白细胞数。 1.2芍药苷的解郁作用初步研究 目的：采用小鼠悬尾抑郁模型,观察芍药苷的抗抑郁作用。 方法：设立模型组、盐酸氟西汀胶囊组,芍药苷100mg/kg、50mg/kg、10mg/kg剂量组共五组,小鼠灌胃给药2天,于末次给药后1h,将小鼠尾端用胶布固定,使其呈倒悬状态,适应2min后,记录4min之内的不动时间。 结果：与模型组比较,盐酸氟西汀胶囊组、芍药苷100mg/kg、50mg/kg剂量组可以缩短小鼠悬尾不动时间(P0.05)。 结论：100mg/kg、50mg/kg芍药苷具有显著的抗抑郁作用。 1.3芍药苷对辐射致血虚结合束缚应激模型大鼠的补血和解郁作用研究 目的：建立辐射致血虚结合束缚应激动物模型,观察造模后模型大鼠体重、行为学、血象、HPA轴以及海马内单胺类递质含量的变化,并在复合模型成功后以此模型为载体研究芍药苷的补血和解郁效果,进而在实验结果的基础上说明中药白芍的养血柔肝作用。 方法：辐射致血虚结合束缚应激动物模型是一种探索性的动物模型,用于探索血虚肝郁证候,以期同时反映出血虚以及肝郁状态。具体造模方法为：首先进行第一次造模,即采用60Co-γ放射源全身照射一次,受照剂量为3.5Gy,制成辐射致血虚模型；在各组大鼠灌胃给药1h后立即采用束缚应激结合单笼饲养的方法进行第二次造模,从而制成辐射致血虚结合束缚应激动物模型。 为能够验证复合动物模型的合理性,实验同时也设计了照射模型组以及束缚模型组,这样可以在分析复合模型的时候能够与经典血虚模型或肝郁模型进行对照,可以更客观地评价出复合模型是否合理,也更容易揭示出复合模型的特点。 具体分组情况：正常对照组(第一组)、照射组(第二组)、照射+茜草片组(第三组)、照射+芍药苷高剂量组(第四组)、束缚组(第五组)、束缚+盐酸氟西汀组(第六组)、束缚+芍药苷高剂量组(第七组)、模型组(第八组)、模型+芍药苷高剂量组(第九组)、模型+芍药苷低剂量组(第十组)。 结果：第3天、第7天其它各组白细胞数显著低于空白组,有统计学差异(P0.001)；第3天、第7天80mg/kg、40mg/kg芍药苷可以显著增加模型组白细胞数(P0.001)。模型组大鼠体重增长缓慢,芍药苷升高体重作用不明显。给予80mg/kg或40mg/kg芍药苷,能增加模型组大鼠蔗糖水消耗量。给予40mg/kg芍药苷,可显著提高模型组大鼠水平、垂直运动评分(P0.001)。模型组大鼠给予80mg/kg或40mg/kg芍药苷,可显著降低测试期触电次数(P0.001或P0.01)。模型组大鼠血浆CORT含量有所升高,40mg/kg芍药苷可以较明显地降低模型组大鼠血浆CORT含量。模型组大鼠海马内5-HT含量有所降低,80mg/kg芍药苷可以显著升高模型组大鼠海马内5-HT含量,与模型组比较有显著性差异(P0.05)。 结论：通过多项指标的综合评价,可以得出辐射致血虚结合束缚应激模型很好地结合了血虚模型和肝郁模型,可以同时反映出血虚肝郁状态。芍药苷对于该模型具有养血柔肝解郁作用。 2芍药苷调控NO/cGMP信号通路的分子机制 2.1芍药苷对海马组织Glu含量的影响 目的：采用辐射致血虚结合束缚应激动物模型,探讨芍药苷对大鼠海马组织Glu含量的影响。 方法：取第一组、第五、六、七、八、九、十组大鼠海马组织,匀浆,离心,取上清液,OPA衍生化,采用邻苯二甲醛(OPA)柱前衍生HPLC荧光检测法测定海马中谷氨酸含量。 结果：模型组大鼠海马Glu含量有所升高,80mg/kg、40mg/kg芍药苷均可降低Glu含量,40mg/kg效果优于80mg/kg,但与模型组无显著性差异。 结论：该模型大鼠海马中Glu蓄积,芍药苷可起到降低该模型大鼠海马组织内Glu含量的作用。 2.2芍药苷对海马组织NO含量的影响 目的：采用辐射致血虚结合束缚应激动物模型,探讨芍药苷对大鼠海马组织信使分子NO含量的影响。 方法：取除去茜草片组的其余各组大鼠海马组织,采用格里斯法(Griess;法),得出各组大鼠海马组织NO含量。 结果：模型组大鼠海马NO含量有所升高,80mg/kg、40mg/kg芍药苷均可降低NO含量,40mg/kg效果优于80mg/kg,但与模型组无显著性差异。 结论：该模型大鼠海马中NO增多,芍药苷可降低该模型大鼠海马组织内NO的含量。 2.3芍药苷对海马组织cGMP含量的影响 目的：采用辐射致血虚结合束缚应激动物模型,探讨芍药苷对大鼠海马组织cGMP含量的影响。 方法：取除去茜草片组的其余各组大鼠海马组织,样品预处理后,采用放射免疫法(RIA)测定cGMP含量。 结果：模型组与空白组相比,cGMP含量明显升高；给予40mg/kg芍药苷后,cGMP含量比模型组有所降低。 结论：40mg/kg芍药苷可以降低血虚结合束缚应激模型大鼠cGMP水平。 2.4芍药苷对NO/cGMP通路各指标基因表达的影响 目的：采用辐射致血虚结合束缚应激动物模型,探讨芍药苷对NO/cGMP通路谷氨酸受体NRl、NR2A、NR2B、 GluRl、 mGluR5,一氧化氮合酶iNOS、 nNOS,磷酸二酯酶PDE5A、PDE2A、PDE9A,鸟苷酸环化酶sGCa2、 sGCβ1基因表达的影响。 方法：实时荧光定量聚合酶链式反应法(RT-qPCR)检测NO/cGMP通路各项指标基因表达。 结果：(一)谷氨酸受体nRNA表达：模型组NR2A较空白组显著升高(P0.001),80mg/kg或40mg/kg芍药苷均可显著降低NR2A mRNA表达水平(P0.001)；模型组GluRl mRNA表达与空白组相比显著升高(P0.01),给予芍药苷80mg/kg或40mg/kg, GluRl mRNA表达较模型组显著降低(P0.01,P0.001)。 (二)一氧化氮合酶NOS mRNA表达：模型组iNOS mRNA基因表达明显高于空白组(P0.001)：80mg/kg,40mg/kg芍药苷较模型组iNOS mRNA基因表达显著降低(P0.001)。 (三)磷酸二酯酶PDE mRNA表达：模型组PDE5A、 PDE2A、 PDE9A mRNA基因表达明显高于空白组(P0.01,P0.001,P0.05)；给予80mg/kg、40mg/kg芍药苷后模型组PDE5A、 PDE2A、 PDE9A mRNA基因表达显著降低(P0.001) (四)鸟苷酸环化酶sGC mRNA表达：模型组sGCa2mRNA表达较空白组显著升高(P0.001),sGCβ1mRNA表达均较空白组有所升高,但无显著性差异;给予芍药苷80mg/kg可以显著降低sGCa2和sGCβ1mRNA表达(P0.001,P0.05),40mg/kg芍药苷也可降低sGCa2和sGCβimRNA表达(P0.001)。 结论：辐射致血虚结合束缚应激模型大鼠谷氨酸受体NR2A、 GluRl mRNA表达增多,一氧化氮合酶iNOS mRNA表达增多,磷酸二酯酶PDE5A、PDE2A、PDE9AmRNA表达上调,鸟苷酸环化酶sGCa2mRNA表达亦上调。即该种造模方法对NO/cGMP通路的以上测定指标均起到上调作用。芍药苷可以下调NO/cGMP通路上所测指标NR2A、NR2B、GluRl、mGluR5、iNOS、nNOS、PDE5A、PDE2A、PDE9A、sGCa2和sGCβ1mRNA表达。 结论 本课题在中医理论指导下,通过研究白芍的主要活性成分芍药苷,验证了中药白芍的养血柔肝作用,并且研究了芍药苷作用于NO/cGMP通路的分子机制。通过综合放血法、Co60y射线照射法制备血虚模型以及小鼠悬尾实验初步得出了芍药苷的养血柔肝作用；探索了血虚肝郁证动物模型的制备方法,制备出辐射致血虚结合束缚应激动物模型;并采用该模型验证了芍药苷的养血柔肝作用,得出芍药苷的柔肝解郁作用可能是通过调节HPA轴,调节脑内5-HT含量来实现的；进一步研究了芍药苷作用于NO/cGMP通路的分子机制,明晰了芍药苷作用于该通路的具体靶点是NR1、NR2A、NR2B、GluRl、 mGluR5、iNOS、nNOS、PDE5A、PDE2A, PDE9A. sGCa2和sGCβ1.本课题深入阐明了养血柔肝这一中药基本理论的科学内涵,为白芍的临床应用提供了实验依据。