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针刀松解法对膝骨关节炎兔软骨基质Col-Ⅱ、Aggrecan基因及蛋白表达的影响

肖红  
【摘要】:骨关节炎是一种退行性骨关节病,是中老年常见病、多发病,在最常见的三大老年病(心脑血管疾病、骨质疏松症、骨性关节炎)中,骨性关节炎发病率在世界范围内居于首位。骨关节炎好发于负重较大的脊柱,膝、髋关节等部位,主要病变是关节软骨的退行性变和继发性骨质增生,临床表现为缓慢进行性发展的关节疼痛、肿胀、僵硬、伴活动受限。严重的影响了患者日常生活和工作,甚至可造成残疾。随着人口老龄化进程加速,这一问题日益突出。因此骨关节炎的防治工作已受到社会广泛关注,对骨关节炎进行研究有着重要的现实意义。目前该病的病因及发病机制还不太清楚。 由于膝关节负重量与活动量较大,因此膝骨关节炎(KOA)也是骨关节炎最常见的一种,一般保守治疗较难且易复发。30多年来,针刀作为一种中医新的微创技术,在KOA的治疗方面取得了较好的疗效,但基础研究尚待深入。本研究通过实验来探讨针刀治疗膝骨关节炎的可能机制,为以后研究奠定基础,也为临床治疗提供理论依据。 研究目的 本实验采用针刀干预并与电针组对照,观察针刀干预对骨关节炎动物模型的关节软骨组织中II型胶原(Col-Ⅱ)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)基因、蛋白表达的影响,从分子生物学角度探讨针刀干预膝骨关节炎的可能机制,为以后研究奠定基础,也为临床治疗膝骨关节炎提供理论依据。 实验方法 将6月龄健康新西兰兔(雌雄各半)随机分为空白组、模型组、针刀组和电针组,采用左后肢伸直位固定制动法(Vidman法)制备膝骨关节炎动物模型。针刀组及电针组于造模结束1周后开始进行干预,针刀组每周干预1次,共干预三周,电针组隔天治疗1次,1周治疗3次,共治疗3周。治疗前后分别观察兔膝关节的行为学指标;大体观察各组关节软骨和滑膜的病理表现;光镜观察各组兔软骨切片的病理表现;Real-timePCR法检测Col-ⅡmRNA、 AggrecanmRNA、 MMP-3mRNA的表达水平,Western blot法检测Col-Ⅱ、Aggrecan、 MMP-3蛋白的表达水平。 结果 1大体观察:空白组兔膝关节无肿胀、充血,关节液透明,关节软骨呈淡蓝色、半透明、光滑,滑膜无水肿、肥厚;模型组兔膝关节明显肿胀、充血,关节液呈浅黄色稍混浊,关节软骨呈灰白色、无光泽,不光滑、不透明,有缺损,可见明显溃疡面及裂隙,有的可见软骨下骨裸露,胫骨内侧髁较明显,滑膜明显充血,水肿、肥厚;针刀组兔左膝关节轻度肿胀无明显充血,软骨颜色淡白,色泽较亮,有轻度缺损,未见到明显溃疡面,关节液透明稍浅黄,与模型组相比水肿与充血程度明显减轻;电针组关节软骨透明度减低欠光泽,有的可见裂隙,滑膜增生减轻,未见明显充血。说明针刀、电针治疗具有减轻软骨损伤、关节水肿的作用。 2光镜观察:空白组兔膝关节软骨结构完整,关节软骨表面光滑,厚度正常,软骨细胞排列整齐,分层清楚,排列有序,软骨基质均匀,潮线较清晰完整,无血管翳生成。模型组软骨表面不光滑,表层软骨细胞稀少,细胞排列明显不规则,层次紊乱,有时可见剥脱缺损深达潮线,软骨细胞巢居,潮线模糊或见双重潮线。针刀组与电针组软骨细胞排列整齐,少见软骨裂隙,但细胞排列仍见局部紊乱,偶见重复潮线,软骨表层比较光滑,未见血管翳形成。对切片按照Mankin法进行评分,四组评分总体差别极显著(P0.01)。针刀组与模型组相比,具有极显著差异(P0.01),与空白组比较差异显著(P0.05),与电针组相比无显著差异(P0.05)。电针组与空白组相比有显著差异(P0.01),与模型组相比差异不显著(P0.05)。针刀松解法有保护软骨的作用。 3行为学改变:模型组、针刀组和电针组Lequesne MG评分分值治疗前统计无显著性差异(P0.05),治疗后和治疗前后计分差值有显著性差异(P0.05)。针刀松解法有效地改善了兔KOA关节疼痛、活动度、肿胀和步态。 4Real-time PCR实验结果显示各组Col-II mRNA的含量表达针刀组较模型组明显升高,二者有显著差异(P0.05);电针组较模型组明显升高,二者有显著差异(P0.05);电针组与空白组有明显差异(P0.05);各组软骨AggrecanmRNA含量表达模型组较空白组明显降低,二者相比有极显著差异(P0.01);MMP-3mRNA表达模型组较空白组明显升高,二者相比有显著差异(P0.05);针刀组较模型组降低,但与空白组相比无明显差异(P0.05),针刀组较模型组降低,但二者无显著差异(P0.05)。说明针刀松解能有效上调Col-ⅡmRNA和AggrecanmRNA表达,下调MMP-3mRNA表达,针刀组效果优于电针组。 5Western blot实验结果显示各组软骨Co1-Ⅱ蛋白含量表达模型组较空白组明显降低,二者相比有极显著差异(P0.01),针刀组较模型组明显升高,二者有有极显著差异(P0.01),针刀组与电针组比较有显著差异(P0.05);Aggrecan蛋白含量表达针刀组较模型组明显升高,二者有显著差异(P0.05),电针组与模型组无明显差异(P0.05)。MMP-3蛋白表达模型组较空白组明显升高,二者相比有极显著差异(P0.01),针刀组较模型组明显降低,二者有有极显著差异P0.01),针刀组与电针组比较有显著差异(P0.05)。说明针刀松解能有效上调Co1-Ⅱ蛋白和Aggrecan蛋白表达,下调MMP-3蛋白表达,针刀组效果优于电针组。 结论 1模型组兔膝关节软骨MMP-3的基因及蛋白含量表达明显升高,而软骨基质Co1-Ⅱ和Aggrecan的基因及蛋白含量表达明显降低,说明基质金属蛋白酶能很好反映膝关节软骨代谢变化,它对关节软骨基质具有降解作用,能加速软骨退变。 2针刀松解法能使关节软骨中MMP-3的基因及蛋白含量表达降低,基质中的Col-Ⅱ和Aggrecan的基因及蛋白含量表达升高,说明针刀松解法有一定的抑制细胞外基质胶原降解,保护促进和刺激软骨修复的作用,为针刀松解法治疗膝骨性关节炎提供了实验研究的依据,揭示了针刀松解法治疗膝关节骨性关节炎的科学内涵。


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