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天南星抗癌有效部位制备工艺及质量控制研究

穆丽莎  
【摘要】:本论文共分五章:第一章为文献综述;第二章为天南星各部位的分离及抗癌活性筛选;第三章为天南星抗癌有效部位制备工艺研究;第四章为天南星抗癌有效部位质量控制方法研究;第五章为总结与讨论。 第一章天南星的研究进展 对近年来天南星的植物来源、本草考证、化学成分、药理作用、临床应用及质量控制研究进展进行了综述,共引用参考文献78篇。 第二章天南星各部位的分离及抗癌活性筛选 对天南星的鲜药材进行提取,并制备不同部位进行抗癌活性筛选。采用组织破碎法将新鲜天南星进行粉碎,得到匀浆。鲜药材与70%乙醇1:2浸泡,每次浸泡3天,过滤得到滤液,连续浸泡3次,合并滤液得到总提物。总提物浓缩通过AB-8大孔树脂水-乙醇梯度洗脱,通过试管反应检测各洗脱流份,得到D-1、D-2、D-3、D-4四个部位。通过抗肿瘤细胞实验,采用PrestoblueTM法检测总提物及4个极性部位对人乳腺癌细胞(SK-BR3)、人肺癌细胞(NCI-H460)、人肝癌细胞(HepG2)、人结肠癌细胞(SW620)4种癌细胞及正常细胞的抑制作用。活性筛选后确定D-3、D-4部位为天南星主要抗癌有效部位。 第三章天南星抗癌有效部位制备工艺研究 对天南星有效部位的提取工艺进行了研究,采用L9(43)正交设计试验方法,以总甾萜提取量、总生物碱提取量和葫芦巴碱提取量为指标,对提取溶剂(A)、溶剂用量(B)、提取时间(C)、提取次数(D)4个因素进行了考察。以总甾萜提取量和总生物碱提取量为指标进行分析,因素A、B、C、D均有显著性差异,最佳提取工艺为A2B3C3D2;以葫芦巴碱提取量为指标进行分析,因素A、B、C均有显著性差异,因素D无显著性差异,最佳提取工艺条件为A2B3C3D1。综合分析正交试验结果,并结合实际生产,确定天南星有效部位最佳提取工艺条件为A2B3C3D2,即A2乙醇浸泡提取D2次,每次提取C3天,溶剂用量为B3倍。 对天南星有效部位纯化工艺进行了研究。以总甾萜和总生物碱的吸附量和吸附解吸率为考察指标,对树脂类型进行了筛选,通过测定分析4种不同类型的大孔树脂对总甾萜和总生物碱的吸附特性,得出A型大孔树脂对总甾萜和总生物碱的吸附量较大,解吸附较容易,吸附后洗脱物中总甾萜和总生物碱的含量较高。最终选择A型大孔树脂作为纯化天南星有效部位的树脂。进而以总甾萜和总生物碱的含量及转移率为主要考察指标对A型大孔树脂纯化工艺的具体实验条件参数进行了考察,分别对其吸附条件、除杂条件、洗脱条件进行了优化,确定最佳树脂纯化工艺为:天南星总提物用40%乙醇溶解,制成浓度为C2mg/mL的上样液,通过A型大孔树脂吸附,上样量与树脂体积比为Y:1,树脂柱径高比为H2,吸附流速为V3BV/h,吸附后用Q1BV40%乙醇除杂,流速I3BV/h,除杂后,用N BV的90%乙醇洗脱,洗脱流速为I3BV/h,收集洗脱液,回收溶剂,干燥,即得天南星有效部位。 对天南星有效部位提取纯化工艺进行了验证。3批样品的制备和含量测定结果表明,天南星有效部位提取工艺合理、稳定。有效部位得率为1.11-1.18%,有效部位总甾萜的含量为5.86%~6.55%,总生物碱的含量为9.48%-11.42%。第四章天南星抗癌有效部位质量控制方法研究 建立了可见分光光度法测定天南星药材、总提物及有效部位中总甾萜的含量测定方法,并对药材提取方法进行了考察。以β-谷甾醇为对照品,测得回归方程为Y=53.147X+0.0201,r=0.9990(n=7),表明β-谷甾醇在0.0049~0.0147mg*mL的浓度范围内与吸光度呈良好线性关系。平均加样回收率为100.54%,RSD=1.22%(n=6)。该方法的准确度、精密度、重复性良好,可作为天南星药材、总提物、有效部位中总甾萜含量测定的方法。 建立了可见分光光度法测定天南星药材、总提物及有效部位中总生物碱的含量测定方法,并对药材提取方法进行了考察。以葫芦巴碱为对照品,测得回归方程为Y=31.73X-0.0156,r=0.9966(n=8),表明葫芦巴碱在0.0083~0.0249mg*mL的浓度范围内与吸光度呈良好线性关系。平均加样回收率为101.02%,RSD=1.77%(n=6)。该方法的准确度、精密度、重复性良好,可作为天南星药材、总提物、有效部位中总生物碱含量测定的方法。 建立了天南星药材、总提物、有效部位中葫芦巴碱的HPLC定量方法。实验测得葫芦巴碱的回归方程为:Y=30988X-430.56,r=0.9995(n=7),实验结果表明葫芦巴碱在0.190~3.792μg/mL浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系,平均加样回收率为100.75%,RSD=0.97%。该方法的准确度、精密度、重复性良好,可作为天南星药材、总提物中葫芦巴碱含量测定的方法。第四章总结与讨论 通过对天南星分离制备得到的各极性部位进行抗癌活性筛选,以4种癌细胞的抑制率为指标,确定了天南星的抗癌有效部位。 对天南星抗癌有效部位制备的提取工艺和纯化工艺条件进行了优化,并对优化的工艺方法进行了验证实验。 建立了天南星药材、总提物及有效部位的质量控制方法,包括天南星药材、总提物及有效部位中总甾萜、总生物碱的含量测定方法,为天南星抗癌有效部位制备工艺的优选提供了方法,并为进一步的新药质量控制研究奠定了基础。


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