蒙药“伊赫汤”对酒精性脂肪肝作用机理的实验研究

【摘要】：目的：通过建立酒精性脂肪肝大鼠模型,试着从药理和分子生物学层面上阐释蒙药伊赫汤对酒精性脂肪肝的作用机理。方法：试验一首先将前脂肪细胞3T3-L1诱导分化为成熟的脂肪细胞,然后随机分为空白组、PBS液组、伊赫汤低、中、高剂量组等五组,每组设三个样本,每个样本20万个细胞。空白组不加任何药物,PBS组加PBS缓冲液,伊赫汤低、中、高剂量组分别加低、中、高剂量伊赫汤,在培养瓶内相同条件下培养48小时。随后提取细胞内的总RNA,进行凝胶电泳,再用实时定量荧光PCR仪检测PPAR a, PPAR y、LXR a的表达情况。试验二选取90只健康雄性Wistar大鼠,进行一周适应性饲养后依据体重进行分层随机,分为空白对照组和模型组,空白组给予蒸馏水,模型组给予高度白酒,以0.9ml/100g体重·日连续灌胃7周进行造模。7周后每组随机选取3只鼠进行肝组织形态学观察,如果已经形成酒精性脂肪肝,将模型组试验鼠再按体重进行分层随机,分为模型对照组、硫普罗宁组、伊赫汤低、中、高剂量组,共设6组。空白组每日上午8：00时和下午14:00时分别以0.5ml/100g(体重)蒸馏水灌胃。每日上午8：00时模型对照组、硫普罗宁组、伊赫汤低、中、高剂量组继续按原剂量灌胃高度白酒,下午14：00时硫普罗宁组以40mg/Kg(体重)硫普罗宁,按0.5ml/l00g(体重)体积灌胃。伊赫汤低、中、高剂量组分别以0.29g/Kg(体重)、0.58g/Kg(体重)、1.16g/Kg(体重)量伊赫汤,按0.5m1/100g(体重)体积灌胃。与此同时每日下午14：00时模型对照组以0.5m1/100g(体重)体积高度白酒灌胃。以此连续灌胃4周,进行治疗。4周后对所有试验鼠进行麻醉,然后腹腔静脉采血,取肝组织。分别检测血清ALT、AST、TC、TG、SOD、MDA、GSH-px、 γ-GT、CDT和肝组织TC、TG、SOD、MDA、GSH-px、y-GT、PPAR a、PPARγ、LXRα以及肝组织形态学、肝细胞凋亡情况、肝指数等。结果：试验一中PPAR a的表达只有在PBS液组和空白组对照时P0.05,显著降低。PPARγ的表达在PBS液组和空白组对照时P0.05,显著增高,伊赫汤低剂量组与PBS液组对照时P0.05,显著降低。LXRα的表达在PBS液组和空白组对照时P0.05,显著增高,伊赫汤低、中、高剂量组与PBS液组对照时P0.05,均显著降低。酒精性脂肪肝模型检测结果显示,空白组肝组织形态学没发生脂肪样变。而模型组肝组织形态学发生了明显的脂肪样变,表明已经形成脂肪肝。肝指数在模型组与空白组对照时P值为0.05 1,几乎发生显著性差异,模型组肝指数显著下降。而伊赫汤高剂量组与模型组对照时P0.01,肝指数显著升高。肝功指标方面血清ALT在模型组与空白组对照时P0.05,显著升高；硫普罗宁组与模型组对照时P0.01,下降非常显著；伊赫汤中、高剂量组与模型组对照时P0.05,显著降低。而血清AST在模型组与空白组对照时P0.05,显著升高；硫普罗宁组和伊赫汤中剂量组分别与模型组对照时P0.05,显著降低。血清γ-GT无论在哪个组之间都未发生显著性差异。而肝组织中的γ-GT在模型组与空白组对照时P0.01,升高非常显著；伊赫汤高剂量组与模型组对照时P0.05,显著降低。氧化应激指标方面血清M1DA只有在模型组与空白组对照时P0.05,显著升高。而肝组织中的MDA在模型组与空白组对照时P0.01,升高非常显著；硫普罗宁组与模型组对照时P0.01,下降非常显著；伊赫汤中剂量组与模型组对照时P0.05,显著下降。血清GSH-px只在模型组与空白组对照时P0.05,显著降低。而肝组织中的GSH-px在模型组与空白组对照时P0.01,下降非常显著；硫普罗宁组和伊赫汤高剂量组分别与模型组对照时P0.05,显著升高。血清SOD在模型组与空白组对照时P0.01,下降非常显著；硫普罗宁组与模型组对照时P0.01,上升非常显著；伊赫汤高剂量组与模型组对照时P0.05,显著升高。肝组织中的SOD在模型组与空白组对照时P0.01,下降非常显著；硫普罗宁组和伊赫汤高剂量组分别与模型组对照时P0.05,显著升高。脂质指标方面血清CT只在模型组与空白组对照时P0.05,显著升高。而肝组织中的TC也只在模型组与空白组对照时P0.01,上升非常显著。血清TG在模型组与空白组对照时P0.05,显著升高；硫普罗宁组与模型组对照时P0.05,显著下降。肝组织中的TG在模型组与空白组对照时P0.01,上升非常显著；硫普罗宁组与模型组对照时P0.05,显著下降。肝组织中的PPAR a、PPAR γ、LXR a受体和其相应的蛋白表达方面受体PPAR α的表达在模型组与空白组对照时P0.01,显著减弱；硫普罗宁组、伊赫汤低、中、高剂量组分别与模型组对照时P0.01,增强非常显著。受体PPARγ的表达在模型组与空白组对照时P0.01,增强非常显著；硫普罗宁组与模型组对照时P0.01,减弱非常显著。受体LXRα的表达在模型组与空白组对照时P0.05,显著增强；硫普罗宁和伊赫汤高剂量组分别与模型组对照时P0.05,显著减弱。相关蛋白的表达结果为,PPARα的表达模型组与空白组比显著减弱；伊赫汤三组与模型组比显著增强,且增强程度与剂量成正比。PPAR y的表达模型组与空白组比显著增强；硫普罗宁组与模型组比显著减弱；伊赫汤三组与模型组比均有所减弱,三组间无显著差异。肝组织油红染色结果显示,模型组组织染色深且面积广,提示脂肪样变较严重；与模型组相比伊赫汤低、中、高剂量组的组织染色和面积有递减趋势,提示脂肪肝好转,且与伊赫汤剂量正相关；硫普罗宁组与伊赫汤高剂量组相差不明显。肝组织tunel染色结果显示,在一个视野范围内与空白组相比模型组细胞凋亡率显著升高,达到68%,P0.01,差异非常显著；硫普罗宁组与模型组相比细胞凋亡率显著下降,降至27%,P0.01,差异非常显著；伊赫汤高剂量组与模型组相比细胞凋亡率显著下降,降至34%,P0.05,有显著差异。血清CDT在模型组与空白组对照时P0.01,升高非常显著；硫普罗宁组和伊赫汤高剂量组分别与模型组对照时P0.05,显著下降。结论：伊赫汤可显著改善由酒精中毒所致的大鼠食欲减退、体重减轻,促进其生长；伊赫汤可通过阻止由酒精所致的肝细胞非正常凋亡,从而改善肝功能,体现解毒的功效；伊赫汤可通过降低MDA而减轻酒精所致的应激氧化反应损伤,同时通过升高SOD、GSH-px而清除自由基,由此达到治疗酒精性脂肪肝的目的；伊赫汤在分子机制方面主要是通过增强PPAR a的表达,减弱LXR a来实现降脂作用的,而且与伊赫汤剂量成正相关；伊赫汤可阻止由酒精中毒所致的肝细胞大量凋亡,且也与伊赫汤剂量成正相关；伊赫汤可显著降低由酒精中毒所致的血清CDT的异常升高,这是伊赫汤具有抗酒精中毒作用的最可靠、最关键的证据。