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糖肾清2号抑制糖尿病肾病免疫炎性损伤机制的探讨及临床疗效分析

王亚南  
【摘要】:目的:实验研究部分通过细胞培养及建立动物模型方法,深入探讨中药复方糖肾清2号调控AMPK信号通路抑制DN免疫炎性损伤的分子机制;临床研究部分评价糖肾清2号对肾阴亏虚、痰瘀热毒证DN患者的临床疗效及安全性。方法:体内实验研究部分:采用SPF级雄性KK-Ay小鼠,经高脂饲料诱导模型3周后,检测空腹血糖及24h尿蛋白水平,DN模型诱导成功标准为:空腹血糖≥13.9mmol/L,24h尿蛋白高于正常组。将30只模型成功KK-Ay小鼠随机分为模型组,阳性药组,糖肾清2号大、中、小剂量组,每组各6只,以6只雄性C57BL/6J小鼠设为正常对照组。中药各组按照所含生药量,分别予糖肾清2号40.66g . kg-1 . d、20.33g. kg-1.d、 10.17g.kg-1.d剂量灌胃,阳性药组予缬沙坦13.33mg . kg-1 . d剂量灌胃,空白对照组及模型组去离子水0.1ml/10g.d灌胃。各组小鼠每日灌胃1次,连续12周。治疗结束后,留取各组小鼠血清及肾组织标本。以RT-PCR技术检测肾组织AMPKα1、ADPN、NF-κB p65、iNOS、MCP-1、TNF-α、IL-6 mRNA转录水平;Western Blot技术检测肾组织AMPKα1、 ADPN、NF-κB p65、iNOS蛋白表达水平;ELISA技术检测IL-6、MCP-1、TNF-α蛋白表达水平;免疫组化技术检测肾组织AMPKα1、ADPN、NF-κB p65、iNOS蛋白表达水平。体外实验研究部分:采用小鼠肾小球系膜细胞株SV40 MES 13,在5%C02,37-C恒温培养箱常规培养。实验分组:空白对照组(D-葡萄糖5.6mmol/L)、高糖组(D-葡萄糖30mmol/L).高糖+TSQ5μmol/L组,高糖+TSQ10μmol/L组,高糖+TSQ20μmol/L组,共同孵育12h、24h、36h进行指标检测。RT-PCR技术检测肾小球系膜细胞AMPKα1、IκBα、 TLR4mRNA转录水平;Western-blot技术检测肾小球系膜细胞株AMPKα1、IκBα、TLR4的蛋白表达水平。临床研究部分:预计收集DN Ⅲ、Ⅳ肾阴亏虚、痰瘀热毒证患者80例。符合设定的纳入标准、排除标准及剔除标准。入组前按1:1比例随机分为治疗组或对照组。治疗组口服糖肾清2号煎剂,每日一剂。对照组口服缬沙坦片,每日一次,每次80mg。疗程为3个月。治疗前需详细记录入组患者姓名、性别、年龄、身高、体重、DN病程、合并用药及合并症等信息。治疗前后需记录DN患者血脂、尿蛋白、血糖等临床检查指标、中医临床症状、舌象及脉象等变化情况。治疗结束后根据疗效评价标准,分析两组患者临床疗效性指标及中医临床症状积分变化情况,分析讨论糖肾清2号的临床疗效。结果:体内实验研究部分:RT-PCR检测结果:与正常组比较,模型组小鼠抑炎因子AMPKα1、ADPNmRNA转录水平明显下降,有显著统计学差异(P0.01)。与模型组比较,阳性药组及中药大、中组AMPKα1mRNA表达上调,有显著统计学意义(P0.01),阳性药组、中药中组ADPNmRNA表达水平上调,有统计学差异(P0.01,P0.05)。与正常组比较,模型组促炎因子NF-κBp65、IL-6、TNF-α、iNOS、MCP-1mRNA表达水平明显升高,有显著统计学差异(P0.01)。与模型组比较,阳性药组及中药各.剂量组NF-κBp65、IL-6、TNF-α、MCP-1mRNA转录水平显著下调(P0.01);阳性药组、中药大组及中药中组iNOS mRNA转录水平下调(P0.01, P0.05)。Western Blot及ELISA检测结果:与正常对照组比较,模型组抑炎因子AMPKα1、ADPN蛋白表达水平明显下降,有显著统计学意义(P0.01)。与模型组比较,阳性药组及中药各组AMPKα1蛋白表达显著上调(P0.01,P0.05);阳性药组ADPN蛋白表达水平显著上调(P0.01),中药各组无统计学差异(P0.05)。与正常组比较,模型组促炎因子NF-κB p65、iNOS、IL-6、MCP-1、TNF-α蛋白表达水平明显升高,有显著统计学差异(P0.01)。与模型组比较,阳性药组及中药各剂量组NF-κBp65、IL-6、MCP-1、TNF-a蛋白表达水平下调,有统计学意义(P0.01,P0.05);阳性药组及中药大组iNOS蛋白表达水平显著下调(P0.01,P0.05)。免疫组化结果:与正常组比较,模型组AMPKα1、 ADPN蛋白表达水平显著下降(P0.01), NF-κBp65、 iNOS蛋白表达水平明显升高(P0.01,P0.05)。与模型组比较,各药物组AMPKα1蛋白表达显著上调(P0.01);阳性药组、中药大组、中药小组ADPN蛋白表达水平上调(P0.01,P0.05);阳性药组、中药大组NF-κBp65蛋白表达水平下调(P0.01);阳性药组、中药大组、中药小组iNOS蛋白表达水平下调(P0.05)。体外实验研究部分:RT-PCR检测结果:与正常组比较,高糖组AMPKal mRNA转录水平在12h、36h时下调(P0.05), IκBα mRNA转录水平在12h、24h下调,有统计学意义(P0.01, P0.05), TLR4mRNA转录水平36h时显著上调(P0.01)。与高糖组比较,TSQ 5μmol/L组AMPKα1 mRNA转录水平在12h、36h上调(P0.01, P0.05),IκBαmRNA转录水平在24h上调(P0.05);TSQ 20μmol/L组AMPKalmRNA转录水平在12h时显著上调(P0.01), IκBαmRNA转录水平在12h时上调(P0.05)。各治疗组TLR4mRNA转录水平在36h下调,有显著统计学差异(P0.01)。Western Blot检测结果:与正常组比较,高糖组AMPKal蛋白表达水平在12h-36h时下调(P0.01, P0.05),IκBα蛋白表达水平在12h-36h显著下调(P0.01), TLR4蛋白表达水平在12h、36h显著增高(P0.01)。与高糖组比较,TSQ 5μmol/L组AMPKα1、IκBa蛋白表达水平在12h-36h时上调(P0.01,P0.05)。TSQ 10μmol/L组AMPKal蛋白表达水平在12h、36h上调(P0.01, P0.05);IκBa蛋白表达水平在12h-36h显著上调(P0.01); TLR4蛋白表达水平在12h时下调(P0.01). TSQ20μmol/L组AMPKal表达水平在12h-36h上调(P0.05), IKBa蛋白表达水平在24h时上调(P0.05), TLR4蛋白表达水平在12h及36h下调,有显著统计学差异(P0.01)。临床研究部分:预计收集Ⅲ、Ⅳ期糖尿病肾病肾阴亏虚、痰瘀热毒证患者80例,实际67例患者完成本次临床观察。①患者一般资料:67例Ⅲ、Ⅳ期DN,随机分为糖肾清2号治疗组34例,缬沙坦对照组33例。治疗组中男性17例,女性17例,平均年龄55.88±7.61岁;对照组中男性18例,女性15例,平均年龄56.08±6.54岁。67例DN患者中符合DNⅢ诊断标准者31例,符合DNⅣ期诊断标准者36例。在DNⅢ期患者中,女性患者比例高于男性,DNⅣ期患者中男性患者比例高于女性。②舌质分布情况:DN Ⅲ、Ⅳ期患者舌质分布规律趋于一致,出现频率最高的是暗红舌,其次为红或淡红舌、紫暗舌,部分患者出现胖大舌,少津,提示在DN Ⅲ、Ⅳ期多见痰瘀证之暗红舌,阴虚之红舌,内有瘀热而出现少津表现。③舌苔分布规律:DN Ⅲ-Ⅳ期舌苔出现频率最高的是薄黄苔,其次为黄腻苔、白腻苔、薄白苔,并出现提示阴虚津少之少苔、花剥苔,表明在DN Ⅲ-Ⅳ期除阴虚之象,痰湿、湿热证候的舌象分布较为普遍。④脉象分布情况:DN ⅢⅣ期出现频率最高的脉象为弦滑脉,其次为沉滑脉,代表阴虚证候的细数脉也占一定比例,滑脉表现较为突出。⑤糖肾清2号临床疗效评价:与治疗前比较,糖肾清2号组Scr水平、24h尿蛋白及尿微量白蛋白水平下降,有统计学差异(P0.05), TC、LDL水平明显下降(P0.01,P0.05)。与对照组治疗后比较,糖肾清2号组Scr、TC、TG、24h尿蛋白、尿微量白蛋白水平下降明显,有统计学差异(P0.05),临床总有效率达73.53%。⑥糖肾清2号中医证候疗效评定:与治疗前比较,糖肾清2号组中医症状积分明显下降,有统计学差异(P0.01),34例患者中显效1例,有效25例,总有效率达76.47%。治疗过程中两组患者空腹血糖、餐后2h血糖、糖化血红蛋白等指标监测均控制在合理水平,血、尿、便常规及肝功能等安全性指标无明显变化。治疗过程中,糖肾清2号组无不良事件发生。结论:糖肾清2号通过发挥AMPK激活剂作用,降低促炎因子表达水平,可有效减轻DN肾组织免疫炎性病理损伤;糖肾清2号针对DN病因病机,可明显改善DN患者临床症状,有效降低尿蛋白、保护肾功能。


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