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推拿对SNI大鼠脊髓腹角和背根神经元凋亡通路中Bcl-2、caspase-3表达的影响

张林峰  
【摘要】:[目的]通过观察坐骨神经损伤(Sciatic Nerve Inj ury, SNI)大鼠脊髓和背根神经元Bcl-2、caspase-3的表达,从线粒体/细胞色素C介导的凋亡通路探究推拿对SNI大鼠神经元凋亡的影响,进一步分析推拿促进周围神经损伤修复的机理。[方法]将91只SD大鼠分为空白对照组、假手术组、模型组、甲钴胺组和推拿组五组,通过坐骨神经夹持造成SNI模型,甲钴胺组干预方法为腹腔注射甲钴胺营养液,推拿组用“按摩推拿手法模拟仪”模拟拨法、点法、揉法三种手法进行推拿干预,穴位选取殷门、承山和阳陵泉处,每穴每法各1分钟,共9分钟。推拿干预后,以斜板试验、坐骨神经功能指数(Sciaticfunctional index, SFI),光热耐痛阈评价大鼠运动、感觉功能的恢复情况;对脊髓腹角、坐骨神经损伤点进行形态学分析,并用TUNNEL染色法观察坐骨神经损伤点处神经元凋亡情况,同时观察坐骨神经电生理和腓肠肌湿重的变化,寻找推拿对损伤神经修复的证据;对脊髓腹角、背根神经节、坐骨神经损伤点处Bcl-2、caspase-3的含量进行检测,阐释推拿促进周围神经损伤后再生和修复的机理。[结果]1行为学——推拿能促进SNI运动、感觉恢复。1.1斜板实验、SFI结果:造模后7天,模型组大鼠斜板实验、SFI评分明显低于空白对照组(P0.05),说明SNI模型制备成功,大鼠出现运动功能障碍。干预7次、20次后,推拿组、甲钴胺组斜板实验、SFI评分与模型组比较明显升高(P0.05),而且干预20次明显高于干预7次,说明推拿干预有效,而且效果在逐步提升,推拿可促进SNI大鼠运动功能恢复。1.2光热耐痛阈结果:造模后7天模型组大鼠光热耐痛阈明显高于空白对照组(P0.05),说明SNI模型制备成功。干预7次、20次后,模型组大鼠光热耐痛阈明显高于空白对照组(P0.05),推拿组、甲钴胺组光热耐痛阈与模型组比较明显降低(P0.05),在20次后推拿组、甲钻胺组光热耐痛阈与空白对照组比较没有差异(P0.05),说明20次治疗后SNI大鼠感觉功能基本恢复正常。2形态学、功能学——推拿能改善大鼠脊髓腹角、神经的微观形态和减少神经元凋亡数量,改善神经传导速度,增加腓肠肌湿重。2.1脊髓腹角HE染色结果:实验显示脊髓腹角HE染色形态学有改变:造模后7天模型组脊髓腹角中存在神经元凋亡,胞体肿胀等表现。干预10次后,甲钴胺组和推拿组的形态学有所改善,模型组改善较差。干预20次后,模型组形态学改变也有所恢复,但仍明显差于正常组,甲钻胺组和推拿组的形态学有改观,且明显优于模型组,神经元排列较为规整,肿胀消失,提示推拿干预能够改善大鼠的形态学表现。2.2坐骨神经HE染色结果:实验显示坐骨神经的HE染色形态学有改变:造模后7天模型组坐骨神经中存在神经元凋亡,胞体肿胀等;坐骨神经可见髓鞘散乱,轴索崩解等表现。干预10次后,甲钴胺组和推拿组的形态学有所改善,模型组改善较差。干预20次后,模型组形态学改变也有所恢复,但仍明显差于正常组,甲钴胺组和推拿组的形态学有改观,且明显优于模型组,神经元排列较为规整,肿胀消失,提示推拿干预能够改善大鼠的形态学表现。2.3坐骨神经损伤点处TUNNEL染色结果:造模后7天,模型组大鼠神经元凋亡数量明显高于空白对照组(P0.05),说明造模后开始有神经元凋亡现象的发生。干预7次、20次后模型组大鼠神经元凋亡数量仍然高于空白对照组(P0.05),甲钴胺组、推拿组神经神经元凋亡数量与模型组比较明显降低(P0.05),说明推拿干预能够降低神经元细胞的凋亡数量,促进神经再生。2.4腓肠肌湿重结果:造模后7天,模型组大鼠腓肠肌湿重明显低于空白对照组(P0.05),说明造模后腓肠肌萎缩。干预7次、20次后模型组大鼠腓肠肌湿重低于空白对照组(P0.05),甲钴胺组、推拿组腓肠肌湿重与模型组比较明显升高(P0.05),说明推拿能够促进腓肠肌的恢复,防止其萎缩。2.5神经电生理结果:造模后7天,模型组大鼠运动、感觉神经传导速度明显低于空白对照组(P0.05),说明造模后神经传导速度降低。干预7次、20次后模型组大鼠神经的运动、感觉神经传导速度低于空白对照组(P0.05),甲钴胺组、推拿组运动、感觉神经传导速度与模型组比较明显升高(P0.05),说明推拿能够促进损伤神经的恢复,干预20次后甲钴胺组、推拿组大鼠运动、感觉神经传导速度仍然低于空白对照组(P0.05),但高于模型组(P0.05),并且20次后推拿组的效果强于第7次,说明推拿干预后神经功能在逐渐恢复。3免疫组化结果——推拿能明显促进脊髓腹角、背根神经节、坐骨神经中的Bcl-2的表达量,降低caspase-3的表达量。3.1 Bcl-2免疫组化结果Bcl-2在脊髓腹角、背根神经节、坐骨神经中免疫组化表达结果造模后7天模型组大鼠Bcl-2在脊髓腹角、背根神经节、坐骨神经中免疫组化表达量明显高于空白对照组(P0.05),表明造模后在损伤处增多。推拿干预7次、20次后模型组、甲钴胺组、推拿组大鼠Bcl-2在脊髓腹角、背根神经节、坐骨神经中免疫组化表达量明显高于空白对照组(P0.05),推拿组、甲钴胺组Bcl-2在脊髓腹角、背根神经节、坐骨神经中免疫组化表达量与模型组比较明显升高(P0.05),而且干预第7次、20次均好于模型组,说明推拿干预有治疗效果,发挥损伤神经保护作用;推拿组Bcl-2在脊髓腹角、背根神经节、坐骨神经中免疫组化表达量与甲钴胺组比较无明显差异(P0.05),说明推拿和甲钴胺对Bcl-2表达均有效。3.2 casepase-3免疫组化结果casepase-3在脊髓腹角、背根神经节、坐骨神经中免疫组化表达结果造模后7天模型组大鼠casepase-3在脊髓腹角、背根神经节、坐骨神经中免疫组化表达量明显高于空白对照组(P0.05),表明造模后在损伤处增多。推拿干预7次、20次后模型组、甲钴胺组、推拿组大鼠casepase-3在脊髓腹角、背根神经节、坐骨神经中免疫组化表达量明显高于空白对照组(P0.05),推拿组、甲钴胺组casepase-3在脊髓腹角、背根神经节、坐骨神经中免疫组化表达量与模型组比较明显升高(P0.05),而且干预第7次、20次均好于模型组,说明推拿干预有治疗效果,发挥损伤神经保护作用;推拿组casepase-3在脊髓腹角、背根神经节、坐骨神经中免疫组化表达量与甲钻胺组比较无明显差异(P0.05),说明推拿和甲钴胺对casepase-3表达均有效。4 Western blot结果——推拿能明显促进脊髓腹角中的Bcl-2的表达量,降低caspase-3的表达量。造模后7天模型组大鼠Bcl-2、casepase-3在脊髓腹角中表达量明显高于空白对照组(P0.05),表明造模后在损伤处表达量明显增多。推拿干预7次、20次后模型组、甲钴胺组、推拿组大鼠Bcl-2、casepase-3在脊髓腹角中表达量明显高于空白对照组(P0.05),推拿组、甲钴胺组Bcl-2在脊髓腹角中表达量与模型组比较明显升高(P0.05);casepase-3在脊髓腹角中表达量与模型组比较明显降低(P0.05),说明推拿干预有治疗效果,能够促进Bcl-2的表达,抑制caspase-3的表达,能够发挥抗凋亡作用,组织神经元凋亡,进而发挥神经保护作用,甲钴胺组和推拿组比较没有差异(P0.05),说明甲钴胺和推拿干预均能发挥神经保护作用。[结论]1推拿干预可以促进SNI大鼠斜板实验、SFI、光热耐痛阈的恢复,提示推拿可以改善SNI大鼠的运动、感觉功能。2推拿干预可以促进受损神经轴突的有髓神经数的增加,促进再生神经与靶器官建立连接,降低细胞水肿程度,和神经再生的关键部位“神经元”的功能恢复。推拿干预改善神经元凋亡情况;促进坐骨神经的运动、感觉神经传导功能的恢复,改善坐骨神经功能,促进损伤神经修复;防止腓肠肌萎缩。3推拿干预可以增加脊髓腹角、背根神经节、坐骨神经中Bcl-2的表达量,降低caspase-3的表达量,进而发挥其抗凋亡作用,促进损伤神经的再生,这应是推拿促进神经损伤修复的起效机理之一。推拿可以促进SNI大鼠运动、感觉功能的恢复,提高神经传导速度,抑制神经元的凋亡,防止腓肠肌萎缩,增加脊髓腹角、背根神经节、坐骨神经中Bcl-2的表达量,降低caspase-3的表达量,进而发挥其抗凋亡作用。


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