清心解瘀方重塑肠道菌群调节动脉粥样硬化脂质代谢作用及机制研究

【摘要】：清心解瘀方是在冠心病“瘀毒”创新病因理论指导下,由陈可冀院士经验方愈梗通瘀汤精简化裁而来。“十二五”国家科技支撑计划开展的一项清心解瘀方对稳定性冠心病患者临床终点事件影响的多中心、大样本、随机、双盲、安慰剂对照研究结果表明,在冠心病二级预防的基础上加用清心解瘀方,可以降低稳定性冠心病患者心源性死亡、非致死性心肌梗死及卒中的发生,并可减少复合终点事件的发生率,且安全性良好。同时,前期研究发现清心解瘀方可以降低炎症反应增强的冠心病患者超敏C反应蛋白(hs-CRP)等炎症因子水平。为进一步探讨清心解瘀方发挥药效的作用机制,本研究在课题组前期工作基础上进行了相关实验研究。研究一清心解瘀方干预稳定性冠心病患者血清代谢组学研究目的:为深入探讨清心解瘀方对机体代谢途径及代谢物产生的影响,本研究在课题组前期工作基础上进行了血清代谢组学研究。方法:课题组前期进行了多中心、随机、双盲、安慰剂对照试验,在常规冠心病二级预防措施基础上,试验组加用清心解瘀方颗粒剂治疗,对照组采用安慰剂作为对照,共治疗6个月,评价清心解瘀方干预稳定性冠心病患者的临床终点疗效和安全性。本实验从其中抽取共93例患者的血样,其中试验组51例,对照组42例。采用UPLC/MS SYNAPT G2-Si进行血清代谢组学研究。将质谱分析所得的原始数据导入配套的Progenesis QI(Waters,Milford,USA)工作站中,将产生的多元数据矩阵导入EZinfo数据处理软件中进行主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA),选出max fold change2,Abundance1000,P value0.05的化合物,对筛选出的化合物进行匹配鉴定,含量分析和代谢通路分析。结果:PLS-DA分析发现,试验组和对照组在治疗6个月后代谢物具有明显差异,能够进行较好的分离。但PCA分析可能因为临床样本的个体差异而无法对差异进行灵敏的分析。基于PLS-DA分析,经过筛选共有17种差异代谢物。与对照组相比,试验组共有10种差异代谢物上调,7种代谢物下调。进一步对这些差异代谢物的代谢通路分析发现,清心解瘀方干预后变化最大的代谢通路为甘油磷脂代谢通路。结论:清心解瘀方对稳定性冠心病患者影响最大的代谢通路是甘油磷脂代谢通路。研究二清心解瘀方干预ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化模型脂质代谢及机制研究目的:根据第一部分对清心解瘀方干预6个月后稳定性冠心病患者血清代谢组学研究结果,清心解瘀方影响的代谢物主要来自甘油磷脂代谢通路,我们采用清心解瘀方干预高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化(AS)模型,观察清心解瘀方对ApoE-/-小鼠AS、脂质代谢、短链脂肪酸代谢及血清炎症因子等的影响。方法:40只雄性ApoE-/-小鼠随机分为4组,每组10只。分别为清心解瘀方低剂量组(Low)、清心解瘀方高剂量组(High)、模型组(Mod)和健康对照组(Chow)。对照组给予无胆固醇低脂饲料[脂肪含量10%(wt/wt),胆固醇含量0%],其余三组给予高脂肪高胆固醇饲料喂养,同时灌胃给予相应药物12周后采集小鼠代谢物、血清、回肠、回盲瓣内容物、肝脏和主动脉。评价各组小鼠主动脉斑块面积、单核/巨噬细胞浸润情况、肝脏组织细胞形态、检测小鼠尿液短链脂肪酸代谢、血清脂质组学、血脂水平、血清白介素-1β(IL-1β)水平、脂代谢相关基因mRNA表达水平、胆固醇逆转运基因mRNA表达水平。结果:清心解瘀方可剂量依赖性地降低ApoE-/-小鼠AS斑块面积和单核/巨噬细胞在斑块部位的水平、肝脏脂肪变性,降低血清低密度脂蛋白(LDL-C)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平,并明显升高高密度脂蛋白(HDL-C)水平,同时可降低血清IL-1β水平。通过对血清脂质代谢进行检测发现,清心解瘀方干预后影响最大的代谢通路是甘油磷脂代谢通路,与第一部分临床样本的结果相符。同时,我们发现了22种差异代谢物。Low组、High组可显著改变甘油磷脂代谢通路中关键酶溶血磷脂酸脂酰基转移酶(AGPAT)、甘油-3-磷酸酰基转移酶(GPAT)、胆碱/乙醇胺磷酸转移酶(CEPT)和卵磷脂-胆固醇酰基转移酶(LCAT)以及肝脏胆固醇代谢和胆固醇逆转运基因清道夫受体B1(SR-BI)、ATP结合盒蛋白A1(ABCA1)、ATP结合盒蛋白G1(ABCG1)、载脂蛋白A1(APOA-1)的mRNA表达水平,与Chow组和Mod组均具有显著差异。清心解瘀方可显著升高小鼠尿液丁酸、异戊酸(ISO-VA)、4-甲基戊酸(4-MEVA)水平。结论:清心解瘀方具有抗AS作用,可改善小鼠脂质代谢、短链脂肪酸代谢及血清IL-11β水平。清心解瘀方对ApoE-/-小鼠甘油磷脂代谢通路影响最大,其机制可能与改变通路中关键酶的mRNA表达水平有关。研究三清心解瘀方重塑高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠AS模型肠道菌群目的:在证实清心解瘀方具有抗AS作用基础上,通过16S rRNA测序初步研究其与肠道菌群的关系,以及抗AS作用与肠道菌群结构变化的相关性。方法:小鼠分组同研究二,采集回盲瓣内容物进行16S rRNA测序。对肠道菌群样本的群落组成和系统发育信息进行alpha多样性、beta多样性和差异物种分析和相关性分析。结果:清心解瘀方可影响高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠AS模型肠道菌群物种丰富度但未影响物种多样性。在所有16S rRNA测序样本中,经过拼接和过滤得到449个不同的操作分类单元(OTUs)。45%的OTUs(202个)为各组共有,而仅有12%的OTUs(55个)为各组特有。这些OTUs经过匹配鉴定,共映射到130个菌属,在各组间大部分菌属(71个)是共有的,仅有19个菌属为特有菌属。四组小鼠肠道菌群构成绝大部分为以下5种肠道菌门:厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和抚微菌门(Verrucomicrobia)。四组小鼠肠道菌群丰度差异前 15位的菌属为Lactobacillus、Lachnospiraceae、Faecalibaculum Lachnospiraceae、Lachnoclostridium、Bifidobacterium、Blautia、Erysipelatoclostridium、A kkermansia、Clostridium、Ruminococcus、Lachnospiraceae_NK4A136_group、Enterorhabdus、Helicobacter、g_unclassified p Firmicutes。清心解瘀方可显著升高Akkermansia(属疣微菌门)的比重,差异具有统计学意义(P0.05)。肠道菌群差异物种与血清HDL-C呈正相关,同时与TC、TG、LDL-C呈负相关的菌属只有Akkermansia菌。3个菌属(Helicobacter,Blautia和Desulfovibrio)同IL-1β均呈现负相关,2个菌属(Bifidobacterium,Ruminococcus_torques_groups)呈正相关。有7个菌属与3种短链脂肪酸水平呈正相关且差异具有统计学意义(P0.05);有5个菌属与3种短链脂肪酸呈负相关且差异具有统计学意义(P0.05)。小鼠肠道菌群网络群落相互作用分析发现,Lachnoclostridium属、Erysipelatoclostridium属、Clostridium属和Blautia属两两呈正相关,提示可能存在共生关系(Community 1)。Bifidobacterium 属、Lactobacillu 属和Faecalibaculum属三者两两呈正相关,提示可能存在共生关系(Community 2)。而两个可能存在共生关系的系统间两两呈现负相关,提示可能存在拮抗关系。Akkermansia属与Erysipelatoclostridium属呈正相关,而与Faecalibaculum属和Lactobacillus属均呈负相关。因此我们推测,清心解瘀方可能通过增加Akkermansia属和产SCFAs菌(Lachnospiraceae,Blautia,Clostridium)的丰度产生抗AS作用。结论:清心解瘀方可重塑肠道菌群结构,并且菌群结构变化与血清脂质水平和抗AS作用具有相关性。