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益肾兴阳胶囊对少弱精子症模型的治疗作用与机制研究

常征辉  
【摘要】:少弱精子症是常见的男性不育疾病之一,其发病率在近些年逐年升高,亟需安全有效的治疗手段。西医治疗本病存在一定的局限性,疗效欠佳,中医药在男性不育的防治方面有独特优势。益肾兴阳胶囊作为一种中成药,早期主要用于治疗阳痿早泄,现在越来越广泛地用于治疗少弱精子症,因此研究并揭示益肾兴阳胶囊治疗少弱精子症的作用机制具有重要意义。然而,目前尚未对其整体的药效机理形成全面的认识,为此迫切需要有效的研究思路和方法来对其药效物质基础及作用机制进行研究,指导临床安全、合理地用药。论文包括文献综述、网络药理学预测和实验研究。文献综述系统总结了近年来中医药对少弱精子症的研究进展,探讨了传统中医药对少弱精子症的认识、中医辨证分型、中药复方研究等进展;从现代医学角度探讨了少弱精子症的病因、睾丸生精功能的调控机制、治疗方法等。以上内容的探讨,为本课题顺利开展做了铺垫。研究目的:本研究拟通过网络药理学预测益肾兴阳胶囊治疗少弱精子症的关键靶点、生物通路等相关机制,为动物实验药效机制研究奠定基础。设计动物实验,观察益肾兴阳胶囊对少弱精子症模型精子质量、生精细胞凋亡、增殖分化、以及精子能量代谢的影响,阐述其作用机制,为益肾兴阳胶囊组方用药及作用机制提供实验探索。研究方法:1.网络药理学通过多个中药成分与靶标数据库收集和筛选益肾兴阳胶囊的化学成分,构建益肾兴阳胶囊作用靶点PPI网络(protein protein interaction network,PPI network);同时从疾病基因数据库对少弱精子症靶点进行检索及筛选;并将疾病基因映射到PPI网络,获取益肾兴阳胶囊治疗少弱精子症的关键作用靶点;构建益肾兴阳胶囊来源中药-成分-靶点-模块-通路网络,通过富集分析预测益肾兴阳胶囊的潜在作用机制。2.实验研究。复制环磷酰胺诱导的少弱精子症小鼠模型,采用精液分析、电镜、流式细胞、Western Blot等方法,对正常组、模型组、益肾兴阳胶囊高、中、低剂量组、枸橼酸氯米芬对照组、万艾可对照组、汇仁肾宝对照组进行精子质量、精子腺嘌吟核苷三磷酸(Adenosine triphosphate,ATP)含量、生精细胞周期、睾丸超微结构、睾丸组织 B 细胞淋巴瘤-2 基因(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)、Bcl-2 相关 X 蛋白(Bcl-2 Associated X Protein,Bax)、磷脂酶肌醇 3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase,PI3k)、蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)、干细胞因子(Stem Cell Factor,SCF)、C-Kit 原癌基因(C-Kit proto-oncogeneprotein,C-Kit)、A 细胞凋亡信号调节激酶 1(Apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK1)、c-JunN 端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)表达的检测。复制雷公藤多苷诱导的少弱精子症大鼠模型,采用精液分析、ELISA、流式细胞、RT-PCR等方法,对正常组、模型组、益肾兴阳胶囊高、中、低剂量组、枸橼酸氯米芬对照组、万艾可对照组、汇仁肾宝对照组进行精子质量、性激素水平、线粒体膜电位、睾丸组织TGF-β1/Smads信号转导通路蛋白、电压依赖性阴离子通道2(Voltage-dependent anion channel 2,VDAC2)、电压依赖性阴离子通道 3(Voltage-dependent anion channel 3,VDAC3)、细胞周期检查点激酶 1(Cell cycle checkpoint kinase 1,CHK1)、细胞周期检查点激酶 2(Cell cycle checkpoint kinase 2,CHK2)蛋白表达的检测。研究结果:1.网络药理学共得到益肾兴阳胶囊418个化学成分、2447个靶点和少弱精子症134个致病基因;其中17个靶点为益肾兴阳胶囊治疗少弱精子症的关键作用靶点,它们参与了 8个关键模块;中药-成分-靶点-模块-通路网络分析发现,其中有57个成分参与调控了关键的作用靶点和关键模块,有可能影响生精细胞凋亡、增殖分化和精子能量代谢。2.动物实验首先模型建立成功,与正常对照组相比,模型动物少弱精子症成立。小鼠实验药效学研究显示,益肾兴阳胶囊可以改善少弱精子症小鼠模型精子质量和精子ATP含量(P0.01);睾丸组织超微结构与模型组相比,益肾兴阳胶囊各组生精细胞、支持细胞线粒体明显增多,轻微肿胀,并且可见正常形态高尔基体,睾丸超微结构改善明显。作用机制研究显示,益肾兴阳胶囊可以调控少弱精子症小鼠模型生精细胞周期、睾丸组织Bcl-2、Bax、PI3k、Akt、SCF、C-Kit、ASK1、JNK 蛋白表达(P0.05)。大鼠实验药效学研究显示,益肾兴阳胶囊可以改善少弱精子症大鼠模型精子质量、性激素水平和精子线粒体膜电位(P0.05)。作用机制研究显示,益肾兴阳胶囊可以调控少弱精子症大鼠模型睾丸组织TGF-β1/Smads信号转导通路、VDAC2、VDAC3、CHK1、CHK2蛋白表达(P0.05)。通过动物实验,验证了网络药理学相关的生物学通路预测。研究结论:1.益肾兴阳胶囊可以显著提高少弱精子症模型精子质量并改善睾丸组织超微结构损伤情况。2.益肾兴阳胶囊可以抑制少弱精子症模型生精细胞凋亡,具体机制可能与调控 Bcl-2、Bax、PI3k、Akt、SCF、C-Kit、ASK1、JNK 蛋白表达有关。3.益肾兴阳胶囊可以改善睾丸的生精功能,促进生精细胞增殖分化,具体机制可能与调控TGF-β1/Smads信号转导通路以及CHK1、CHK2蛋白表达有关。4.益肾兴阳胶囊可以增强少弱精子症模型精子能量代谢,具体机制可能与提高线粒体膜电位、增强VDAC2、VDAC3蛋白表达有关。综上所述,本研究证实了益肾兴阳胶囊具有补肾精、促生殖的治疗效果,也揭示了益肾兴阳胶囊通过抑制生精细胞凋亡、促进生精细胞增殖分化、增强精子能量代谢治疗少弱精子症的相关作用机制。


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