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从肝论治失眠及四逆酸枣仁合方疗效的生物学基础研究

张蔚  
【摘要】:失眠是临床常见的睡眠障碍,严重影响患者的身心健康。中医药治疗失眠疗效确切,许多古籍和现代文献强调从肝论治失眠,积累了理论及大量处方用药经验,但缺乏系统性归纳总结;同时从肝论治失眠的现代生物学机制尚不明确。目的本研究拟整理近十年从肝论治失眠的文献,分析其中的用药规律、核心药物及组方思路。在此基础上,以导师疏肝养血法治疗失眠的四逆酸枣仁合方作为切入点探讨从肝论治失眠的作用机制,通过网络药理学方法对其治疗失眠的生物学基础进行多角度多层面解读,并在前期GABA能系统与失眠相关研究的基础上,从睡眠、情绪、记忆能力等角度宏观评价药物疗效,从GABA的合成代谢角度验证网络药理学结果,明确合方干预失眠的作用靶点,从理法方药角度综合分析对从肝论治失眠的认识,为进一步临床研究奠定基础。方法文献研究:1.以知网、维普、万方数据库为来源进行文献检索,筛选后录入处方药物,统计药物的使用频次、性味、归经及功效,并利用古今医案云平台分析高频药物的剂量分布。在此基础上,利用中医传承辅助平台及SPSS软件对全药物集及高频药物集进行关联分析和聚类分析,探寻药物的关联规律与组方思路;利用Gephi软件构建药物的复杂网络,寻找从肝论治失眠的核心药物。2.首先通过TCMSP、TCMID数据库筛选合方药物的活性成分并进行靶点预测,对预测靶点进行富集分析。然后利用OMIM、GeneCards数据库获取失眠的治疗靶点,与药物的预测靶点映射得到合方治疗失眠的潜在靶点。在此基础上,分析各药物间共成分、共靶点情况,并利用Cytoscape软件构建成分-靶点-疾病网络和治疗靶点的蛋白互作网络,通过拓扑分析筛选网络的核心节点,得到合方治疗失眠的关键效应成分及核心治疗靶点。对治疗靶点进行通路富集分析,并分析各药物对通路的共同调控作用。实验研究:1.以PCPA腹腔注射法建立大鼠失眠模型,通过戊巴比妥钠翻正实验、蔗糖水偏好实验以及Morris水迷宫实验进行模型评价。在此基础上,将失眠大鼠随机拆分成1个模型组与4个药物组,分别予以生理盐水、阳性药物艾司唑仑、四逆散、酸枣仁汤及四逆酸枣仁合方进行灌胃,连续给药7天后观察大鼠的行为状态,并通过上述行为学实验中的睡眠潜伏期、睡眠持续时间、蔗糖水偏好率、平台穿越次数等指标对药效进行评价。2.取大鼠双侧海马处理备用,采用蛋白免疫印迹技术检测各组大鼠海马中GAD65、GAD67、GABA-T、GAT-1、SSADH的含量;采用实时荧光定量PCR技术检测以上靶点的mRNA表达。结果文献研究:1.结果显示,从肝论治失眠使用最多的三类药物为补虚药、安神药和清热药;性味归经分析中,热性药物最少,以甘、苦、辛味为主,多入肝、心、脾三经。使用频次不低于30次的药物共33种,其药物功效及性味分布情况与全药物集基本一致,无热性药物;剂量分布范围较广。对全药物集进行关联规则分析,取支持度≥50、置信度≥0.9时得到57个药物组合,以及白芍,茯苓→柴胡的强关联规则;取支持度≥40、置信度≥0.9时得到117个药物组合以及6个关联规则,主要围绕柴胡、酸枣仁、白芍、甘草、茯苓等药物展开。复杂网络分析发现核心药物为柴胡、白芍、甘草和酸枣仁。聚类分析发现柴胡-枳壳-香附、栀子-龙胆草-滑石等5个核心组合,并在此基础上获得新方组合5个。2.数据库检索得到合方8味药物的活性成分共144个,含7个多药物共有成分。活性成分的预测靶点共229个,包括9个多药物共同作用靶点,富集得到的KEGG通路及GO条目涉及53种疾病,涵盖多种生物功能活动。从中筛选得到合方治疗失眠的潜在靶点共70个,富集于多条免疫炎症反应通路、低氧状态下血管新生以及GABA能突触活动、多巴胺能突触活动等相关通路,其中神经活性受体-配体相互作用、TNF信号通路、钙离子信号通路和多巴胺能突触活动为半数以上药物共同作用的通路。在此基础上通过网络分析得到槲皮素、山奈酚等18个合方治疗失眠的关键成分,以及IL6、TNF、VEGFA、FOS、IL1B、CREB1、CAT、IL10 共 8 个核心治疗靶点。实验研究:1.成功复制PCPA腹腔注射失眠模型。造模组大鼠昼夜节律消失,睡眠时间减少,进食饮水减少,体重下降,喜静少动,与正常大鼠相比睡眠持续时间非常显著性减少(P0.01),睡眠潜伏期明显延长(P0.05),蔗糖水偏好率无明显变化(P0.05)。Morris水迷宫空间探索实验中,模型组大鼠通过平台位置的次数及目标象限停留时间占总时间的比值均显著低于正常组大鼠(P0.01,P0.01)。药物干预后,各给药组大鼠体重呈现升高趋势,精神状态及自发活动趋向正常;与模型组相比,睡眠潜伏期显著性缩短(P0.05),睡眠持续时间显著性增加(P0.05),其中合方组大鼠的睡眠潜伏期及四逆散组大鼠的睡眠持续时间改善非常显著(P0.01)。各组大鼠的蔗糖水消耗率无明显差别(P0.05)。Morris水迷宫空间探索实验中,各组大鼠的搜索策略均由边缘式向随机式、趋向式转化;与模型组相比,阳性药物组和四逆散组大鼠通过平台次数及目标象限停留时间占比无明显差异(P0.05);合方组和和酸枣仁汤组大鼠通过平台次数显著增加(P0.05),目标象限停留时间占比非常显著性增加(P0.01)。2.蛋白免疫印迹实验中,与正常组相比,模型组大鼠海马内GAT-1、GAD67、GAD65、GABA-T蛋白表达显著性降低(P0.05,P0.05,P0.01,P0.01),而SSADH蛋白表达无明显差异(P0.05)。与模型组相比,阳性药物组大鼠海马内GAD65、GAT-1蛋白表达表达显著增加(P0.01,P0.05),SSADH、GABA-T、GAD67蛋白表达无明显差异(P0.05);合方组大鼠海马内GAD67、GAD65、GAT-1蛋白表达显著增加(P0.01,P0.05,P0.05),SSADH、GABA-T 蛋白表达无明显差异(P0.05);四逆散组大鼠海马内GAT-1蛋白表达显著性增加(P0.05),SSADH、GABA-T、GAD65、GAD67蛋白表达无明显差异(P0.05);酸枣仁汤组大鼠海马内各指标蛋白表达均无明显差异(P0.05)。实时荧光定量PCR实验中,与正常组相比,模型组大鼠海马内GAT-1、GAD65、GAD67、GABA-T 的 mRNA 表达均非常显著性下调(P0.01,P0.01,P0.01,P0.01),而SSADH的mRNA表达无明显差异(P0.05)。与模型组相比,阳性药物组大鼠海马内GAD65、GAD67和GAT-1的mRNA表达均非常显著性上调(P0.01,P0.01,P0.01),SSADH 和 GABA-T 的 mRNA 表达无明显差异(P0.05);合方组大鼠海马内GAD65、GAT-1、GAD67、GABA-T的mRNA表达均显著上调(P0.05,P0.05,P0.01,P0.01),SSADH 的 mRNA 表达无明显差异(P0.05);四逆散组大鼠海马内GAT-1、GAD67、GAD65、GABA-T的mRNA表达均显著上调(P0.05,P0.05,P0.01,P0.01),SSADH 的 mRNA 表达无明显差异(P0.05);酸枣仁汤组大鼠海马内GAD65的mRNA表达非常显著性上调(P0.01),其余指标均无明显差异(P0.05)。结论本研究发现,从肝论治失眠多见行气疏肝、养血安神的配伍思路,提示从肝论治失眠要顺应肝体阴用阳的特点,注重疏肝与养血并行,与四逆酸枣仁合方组方思路高度一致。该方治疗失眠存在药物成分浓度及靶点作用叠加现象,疗效机制可能与低氧状态下血管新生以及GABA能突触活动、多巴胺能突触活动相关通路有关,揭示了从肝体用两端论治失眠的生物学基础。PCPA失眠模型大鼠表现出入睡困难、睡眠缩短、记忆力减退等失眠相关症状,予疏肝行气、柔肝养血的四逆酸枣仁合方干预后,大鼠睡眠及记忆能力得到有效改善,通过分子生物学实验进一步验证,该方可能通过调控GABA合成、代谢系统的关键靶点,促进GABA合成,发挥其神经保护作用来治疗失眠,为相关临床研究提供了依据。


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