中医药防治COVID-19的处方用药规律挖掘及生物信息学研究

【摘要】：背景新型冠状病毒肺炎(Coronavirus Disease 2019,COVID-19)在全球范围内大流行,严重威胁人类生命健康。中医药在中国COVID-19疫情防治中疗效明确,发挥了不可或缺的作用。本研究立足COVID-19这一国际公共卫生紧急事件,从流行病学、处方规律、分子对接、生物信息分析、方症对应等方面,对中医药防治COVID-19的客观疗效、作用机制,方症特点及抗新型冠状病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2,SARS-CoV-2)的潜能进行深入研究。目的(?)医药使用覆盖率与COVID-19治愈率的相关性。(?)医药防治COVID-19的处方用药规律。(?)分子对接筛选具有抗SARS-CoV-2潜能的中药及化合物。(?)中药防治COVID-19的分子机制。(?)量化中医药防治COVID-19的方-病/症疗效评价方法。方法1.中医药使用覆盖率与COVID-19治愈率的相关性研究从国家及各省市中医药管理局、卫生健康委员会等收集防控COVID-19的中医药使用覆盖率。从中国疫情网获取各省市COVID-19累计治愈人数与累计确诊人数,计算治(?)绘制各省市中医药使用覆盖率与COVID-19治愈率的折线图,并以地图形式呈现区域分布。运用Pearson或Spearman相关分析评估相关性。2.中医药防治COVID-19数据库的构建与处方用药规律挖掘从国家及各省市颁布的COVID-19中医药防治方案、政府推荐方案、医院协定处方、院专家自拟方等资料中收集防治COVID-19的中医处方(以下简称“新冠方”)信息,构建“中医药防治 COVID-19 数据库”(TCM database on COVID-19 prevention and treatment,TDCPT)。溯源新冠方中所含基础方,统计各基础方对应新冠方的数目,定义TOP10为核心基础方,构建其与对应新冠方的网络。分析中药的应用频次,定义TOP10为核心中药,10次及以上者为常用中药,归类常用中药的功效属性,以反映COVID-19的中医治法。3.筛选与挖掘具有抗SARS-CoV-2潜能的中药及化合物从TCMSP数据库获取核心中药的潜在靶标,通过UniProt数据库标准化为基因符号。基于TCMSP的所有靶标构建中、药靶标总择,作为四格表χ2检验的总集(all targets for chi-square,ATC)。从 GeneCaI-ds 与 NCBI gene 中获得 COVID-1 9 靶点,与 ATC 取交集,得到 χ2 检验中 COVID-19 靶点的总和(COVID-19 targets for chi-square.CTC),即四格表的列总和。核心中药的靶标数为行总和。基于χ2检验及Phi系数(Φ),评估核心中药的靶标与CTC的相关性,筛选具有抗SARS-CoV-2潜能的关键中药。基于分子对接技术,进一步挖掘关键中药抗SARS-CoV-2的潜在化合物。以前期报道具有治疗COVID-19潜能的7种西药(瑞德西韦、利托那韦等)作为阳性对照,SARS-CoV-2 的 2 个关键蛋白:新型冠状病毒 S 蛋白[CoV spike(S)glycoprotein with a single receptor-binding domain;PDB ID:6VSB]与 3CL 水解酶(CoV 3CL hydrolase;PDB ID:6LU7)作为受体,关键中药的所有化合物与阳性对照作为配体。从PubChem数据库获取配体结构,从PDB数据库获取受体3D晶体结构,将其导入Schrodinger小分子药物研发组件,进行预处理,并明确对接活性□袋。运用Glide模块分别进行分子对接,以对接得分表征对接效能,筛选对接得分低于阳性对照者为抗SARS-CoV-2的潜在化合物。拓宽配体库,纳入天然产物化合物库中的所有化合物,重复上述方法进行广谱筛选。4.中药多维调控COVID-19的机制探究从TCMSP数据库中溯源关键中药靶标对应化合物的频次(Target Counts,TC),运用R version 3.6.3构建中药-靶标-TC矩阵,筛选至少6味药均含有的靶标。检索文献,以至少3篇文献同向为定向依据,明确靶标方向。运用Python Seaborn绘制定向热图。基于IPA通路分析系统,将靶标权重(TC加和)与调控方向作为“Log2foldchange”一并导入,进行定向通路富集分析。分别筛选上调组与下调组7^0.05的TOP10关键通路,通过Pathway builder tool 2.0构建关键中药防治COVID-19的机制网络。5.探讨量化中医药防治COVID-19的方-病/症疗效评价方法基于文献检索,获得COVID-19相关症状、体征及疾病(symptoms,syndromes and medical conditions;SSMs)。从 GeneCards、NCBI gene 获取 SSMs 靶点。筛选防治 COVID-19的优效处方,在TCMSP、ETCM、TCMID等数据库中收集各方的靶标。中药与SSMs的靶点均须包含在ATC(all targets for chi-square)中。基于χ2检验,以-LogioP作为相关显著性指征(significance level of coherence,SLC),量化方-病/症的疗效特性。运用Python Seaborn,构建优效处方与SSMs的SLC热图,绘制TOP SLC的方症分布散点图。结果1.共获取30个省市的中医药使用范盖率与COVID-19治愈率情况,Spearman相关分析显示,中医药使用覆盖率与COVID-19治愈率呈显著正相关(rs=0.68,P=3E-05)。2.构建中医药防治COVID-19数据库(TDCPT),共纳入新冠方185个,含中药210味,溯源基础方49个。核心基础方为麻杏石甘汤、银翘散、玉屏风散、麻杏苡甘汤、参附汤、宣白承气汤、生脉饮、藿朴夏苓汤、藿香正气散和达原饮,其应用分期各有侧重。常用中药共49味,治法涉及清热、化痰止咳平喘、解表、补虚、化湿等。核心中药为甘草、杏仁、金银花、连翘、石膏、麻黄、黄芩、藿香、黄芪和芦根。3.构建获得中药调控靶标总库,含有3.439个靶标,即ATC(all targets for chi-square)=3.439。获得 COVID-19 疾病基因与ATC 的交集数(COVID-19 targets for chi-square,CTC)为172个。核心中药靶标与CTC均具有显著相关性(P0.01)。芦根及石膏的相关系数Φ0.1,故剔除。余8味药作为关键中药,通过分子对接进一步筛选抗SRAS-CoV-2的潜在化合物。关键中药的919个化合物中,有17个表现出潜在活性,优于最佳阳性对照,源自金银花、黄芪、麻黄、甘草和连翘。在2.042个天然产物化合物的广谱筛选中,新增82个潜在化合物,溯源57种天然产物,包括人参、银杏、红茶等。5-甲氧基-乔松苷等5个化合物具有与6LU7、6VSB均更优的结合效能。4.①中药-靶标-TC矩阵:构建形成53x8的中药-靶标-TC矩阵。检索文献414篇,明确靶标调控方向,剔除超4味药无相关研究的靶标20个,获得核心靶标33个。②核心靶标定向热图:涉及免疫调节因子的激活(IL10↑),急性炎症反应的抑制(IL-6↓,TNF↓,COX2/1↓,NOS21等),抗氧化活性的增强(CAT↑,SOD1↑)及对细胞凋亡的调节(CASF3↓,CASP8↑)。③IPA通路富集分析:获得P0.05的上调通路129个,包括PPAR信号通路、干扰素信号通路、Th2通路等;下调通路335个,包括PKR在干扰素诱导和抗病毒应答中的作用、IL-17A信号通路、IL6信号通路等。④构建获得关键中药防治COVID-19的机制网络。5.①14个SSMs:COVID-19典型症状与体征-发热、咳嗽或干咳、淋巴细胞减少、乏力、肌肉酸痛、呼吸困难;其它症状与体征-咳痰、腹泻、恶心呕吐,血氧饱和度降低和细胞因子风暴;疾病:COVID-19、SARS和肺炎。②18首代表中医处方:预防:刘尚义预防方;出现症状但未确诊:藿香正气散、金花清感颗粒、连花清瘟胶囊;确诊及轻中症:麻杏苡甘汤、麻杏石甘汤、清肺排毒汤、化湿败毒方;危重症:热毒宁注射液、参附汤、宣自承气汤、血必净注射液;恢复期:生脉注射液;特色基础方:达原饮(抗瘟专方)、叫君子汤(补气专方)、二陈汤(化痰专方)、玉屏风散与银翘散(高频基础方)。③相关性分析:18首方,14个SSMs,共运行252次χ2检验,P均小于0.01,表明18首方与14个SSMs均具有显著相关性。以SLC排序量化方-病/症拟合的疗效特性,并可视化为热图。其结果与临床应用相符。如:生脉饮的SLC突出在乏力,对发烧、咳嗽则为低值;参附汤则对乏力、淋巴细胞减少、细胞因子风暴表现高SLC值。④TOPSLC的方症分布散点图:热毒宁注射液在14个SSMs均居TOP5。靶标数目1000的方剂中,银翘散、金花清感颗粒、连花清瘟胶囊、清肺排毒汤在各SSMs的SLC较高。结论1.我国各省市中医药使用覆盖率与COVID-19治愈率在新冠肺炎早期呈显著正相关。2.新冠方多由麻杏石甘汤、银翘散等基础方化裁而来,主要涉及清热、化痰止咳平喘、解表、补虚、化湿等治法,重视气阴、兼化湿邪,标本兼治。3.从金银花、连翘等关键中药中获得17个抗SARS-CoV-2的潜在成分,广谱筛选后新增82个。多种潜在成分可溯源至同一中药,而新冠方由多味中药构成,其间形成的多种抗SARS-CoV-2潜在成分的协同效应是配伍增效的可能机制。4.中药可能通过激活 IL10、CAT、SOD1、CASP8 等,抑制 IL-6、TNF、COX2/1、NOS2、CASP3等靶标,上调PPAR信号通路、干扰素信号通路、Th2通路等,下调PKR在干扰素诱导和抗病毒应答中的作用、IL6信号通路等,多维平衡调控COVID-19病程中病毒复制、炎症、氧化应激、细胞凋亡等生物过程。5.以SLC评估中医处方治疗病/症的适用性,或可作为中医药防治COVID-19的方-病/症疗效的量化评价方法。