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大蒜素预处理延迟保护作用及其信号转导机制的研究

傅俊英  
【摘要】: 背景: 冠心病在40~49岁人群中发病率为58.36%,死亡数占人口死亡数的1/3~1/2,占心脏病死亡数的50%~75%。缺血预处理具有强大保护缺血心肌作用,用药物尤其是中药诱导这种内源性调控保护可能是极积有效治疗冠心病新途径。 目的:探索能够模拟缺血预处理延迟保护作用的中药,研究大蒜素延迟保护的效果及其信号转导作用机制。 方法: 大蒜素延迟保护作用的整体动物实验部分:健康新西兰大白兔32只,随机分为缺血再灌注组(30min缺血和2h再灌注损伤)、缺血预处理组(4次5min缺血5min再灌注预处理)、大蒜素预处理大剂量组(1.0mg/kg大蒜素预处理)、大蒜素预处理小剂量组(0.5mg/kg大蒜素预处理)。分别进行预处理(除缺血再灌注组)24h后,再结扎冠状动脉左前降支30min,复灌2h,造成缺血再灌注损伤模型。观察心肌梗死范围(梗死区心肌重量占危险区心肌重量的百分比)、血流动力学(HR、LVEDP、LVPSP、CF、±dp/dt max)、电镜下心肌超微形态结构、生化指标(血浆LDH、CK活性及组织匀浆液MDA、Mn-SOD含量)改变情况。 大蒜素延迟保护作用的离体细胞实验部分:利用培养的离体乳鼠心肌细胞模型,研究①大蒜素预处理延迟保护的量效关系:5、10、20、50μg/ml浓度大蒜素与乳鼠心肌细胞共同孵育30min进行预处理,24h后,用细胞存活率、细胞内外LDH活性及MDA生成等指标来观察不同剂量大蒜素对细胞低氧复氧损伤(2h低氧,2h复氧)的影响以探讨大蒜素预处理延迟保护作用的剂量-效应关系。②大蒜素预处理延迟保护的时效关系:20μg/ml浓度大蒜素与细胞共同孵育30min进行预处理后,在12、24、36h分别进行低氧复氧损伤,以观察大蒜素预处理延迟保护作用的时间-效应关系。③信号阻断剂对大蒜素预处理延迟保护作用的影响:PKC阻断剂H-7或MAPK阻断剂PD98059与细胞共同孵育10min后,再用大蒜素(20μg/ml)预处理30min,24h后观察信号阻断剂对大蒜素延迟保护作用的影响。④在此基础上,进行大蒜素预处理延迟保护作用的信号转导机制研究:大蒜素以及大蒜素加H-7或PD98059预处理24h后,直接用免疫杂交法测定细胞裂解液中nPKC-ε、HSP70和NF-κB的蛋白表达情况。 结果: 整体动物实验部分:①缺血损伤使心肌梗死区重量占危险区重量百分比达52.9±6.5%,缺血和大蒜素(1mg/kg体重)预处理使百分比分别降至24.6±5.0%、36.7±5.5%(P0.05)。②大蒜素(0.5、1mg/kg体重)预处理使复灌末LVEDP较缺血再灌损伤组分别降低32.34%及56.56%(P0.01或P0.05);LVPSP分别提高61.58%及94.33%(P0.05);+dp/dt分别增加19.94%及49.84%(P0.05)。-dp/dt分别增加24.17%及51.33%(P0.05 或P0.01)。但对动物HR、CF无明显改善作用。③缺血损伤后出现细胞、线粒体肿胀,肌丝结构不清,Z线模糊,毛细血管内皮细胞肿胀等改变。大蒜素预处理有明显改善作用。大蒜素大剂量组效果优于 WP=5 小剂量组。④大蒜素(0.5、1mg/kg体重)预处理可使血浆LDH活性较缺血再灌损伤组分别降低30.51%、34.96%(P0.05),组织匀浆液中MDA含量分别减少23.74%、21.72%(P0.01)。 离体细胞实验部分:①大蒜素5、10、20μg/ml剂量组的生存率分别为86.01%、87.45%、94.42%,明显高于低氧复氧损伤组的76.65%( P0.01)。20μg/ml组与低氧预处理组的96.45%比, P0.05。50μg/ml组细胞存活率为38.34%,低于低氧复氧损伤组( P0.01)。APC20组上清液中LDH活性较低氧复氧损伤组降低46.77%(P0.01)。APC5、10、20、50 μg/ml组上清液中MDA较低氧复氧损伤组分别降低38.29%、52.03%、45.96%、27.80%(P0.01)。APC 10、20 μg/ml组与低氧复氧组比较,细胞内液中LDH活性分别提高1.20、1.78倍(P0.01)。APC5、10、20组细胞内液中MDA则分别降低40.77%、51.27%、59.02%(P0.01)。②12、24h组细胞存活率分别为70.03%、77.14%,较低氧复氧损伤组的65.16%明显提高( P0.05或 P0.01)。36h组的63.20%与低氧复氧损伤组无明显差异。24h组使上清液中LDH活性明显降低,细胞内液中LDH明显增高,同时明显减少细胞内、外液的MDA含量( P0.05或 P0.01)。12、36h组仅能减少细胞内液中MDA的生成(P0.01)。③H-7、PD98059拮抗剂组较大蒜素预处理组存活率分别下降15.71 %、12.43%(P0.01)。上清液中LDH活性分别增加42.40%、30.73%(P0.05)。上清液中MDA含量分别增加85.14%、1.27倍(P0.05或P0.01)。细胞内液中LDH活性分别降低44.33%、39.80%(P0.05)。细胞内液MDA含量分别增加69.59%(P0.05)、1.27倍(P0.01)。④同时大蒜素及缺血预处理24h后,PKC-ε表达分别增加33.58%、31.01%(P0.01),HSP70表达分别增加36.62%、43.66%(P0.01),而PKC抑制剂H-7、MAPK抑制剂PD98059可分别完全抑制两种蛋白表达的增加。NF-κB在各组预处理24h后均无表达。 结论:大蒜素能模拟缺血预处理延迟保护作用,减少心肌细胞死亡,促进心肌形态、功能恢复,减轻过氧化损伤。且在一定范围内呈剂量-效应关系。这种保护作用在预处理后12h产生,24h作用最强,36h基本消失。其作用机制可能与大蒜素激活信号转导途径,通过PKC-ε-MAPKs通路,促进HSP等表达上调,蛋白合成加速有关。


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