慢性束缚应激大鼠模型的证治相关性研究

【摘要】： 证治相关性研究是中医诊断学中有关证研究的薄弱环节，近年来也成为了中医诊断学研究的一个热点。应激是机体的非特异保护适应机制，但它也引起机体自稳态的变动，甚至导致疾病。导致机体应激反应的因素是多方面的，可以是躯体的、心理的，也可以是社会文化的，应激的变化可涉及多个系统，引起体内组织学、生理学、生化学改变，尤其与神经内分泌和免疫系统关系密切。有研究表明在社会流行病中约75%-90%与应激有关，应激的作用已越来越受到人们的重视。特别是近十多年来，有关应激的研究在整个人类健康的研究中占据了一个十分显著的地位。 本课题目的在于：①建立慢性束缚应激大鼠的动物模型并进行评价；②从理论研究和动物实验研究两个方面，系统地探讨了慢性束缚应激的病理生理基础；③对比研究逍遥散、四君子汤和金匮肾气丸三种中药复方抗应激的作用机理；④探讨慢性束缚应激大鼠模型的中医证治相关性。 本论文为国家自然科学基金资助项目(№:30000216)与霍英东教育基金资助项目(№:81037)的主要内容之一，分为理论研究和实验研究两部分。 理论研究：主要探讨了以下几方面的内容。①应激的概念和分期；②中医对应激原的认识，以及中医肝、脾、肾三脏在应激中的作用及慢性束缚应激的主要病机；③应激动物模型的制作；④应激与神经内分泌免疫网络的关系；⑤应激与神经肽的关系；⑥应激和微量元素锌和硒的关系。 实验研究： 实验一、慢性束缚应激大鼠模型的建立、评价及中药复方的影响。 本实验的目的在于①探讨慢性束缚应激状态下大鼠行为学的变化；②探讨三个复方对慢性束缚应激大鼠行为变化的影响；③探讨慢性束缚应激时大鼠进食量和体重的变化；④对比不同治疗方法对慢性束缚应激大鼠进食量和体重的影响；⑤对慢性束缚应激大鼠模型的进行评价。 将二级雄性SD大鼠60只，随机分为正常对照组、7天模型组、21天模型组、四君子汤组、逍遥散组、金匮肾气丸组6组，每组各10只。实验所用的中药复方分别选用《太平惠民和剂局方》中的逍遥散（北柴胡30g、当归30g、白芍30g、白术30g、茯苓30g、炙甘草15g、生姜10g、薄荷10g）、四君子汤（党参30g、白术15g、茯苓15g、炙甘草10g）和《金匮要略》中的金匮肾气丸（干地黄60g、山药30g、山茱萸10g、泽泻15g、茯苓15g、牡丹皮15g、桂枝10g、炮附子10g）。以上药物按一定的工艺制成药粉备用。以慢性束缚方法制作应激大鼠模型，将大鼠束缚于特制的束缚架上，每日3小时，连续21天(B组为7天)。自造模第一日始，各用药组每日在束缚前1小时分别灌服逍遥散、四君子汤、金匮肾气丸，其它各组则灌服等体积的蒸馏水。每日称量大鼠体重、计算进食量，实验结束前做行为学测定（包括旷场实验和鼠尾悬挂实验）。 实验二、慢性束缚应激大鼠模型免疫功能的变化及中药复方的影响 研究目的为：①研究慢性束缚应激时大鼠免疫器官的变化情况；②研究慢性束缚应激时 WP=6 免疫细胞功能的变化；③研究慢性束缚应激时血清免疫相关细胞因子的改变；④对比三个复方对慢性束缚应激时机体免疫器官、免疫细胞功能以及血清细胞因子的调节作用。 将大鼠分为正常对照组、7天模型组、21天模型组、逍遥散组、金匮肾气丸组、四君子汤组6组。造模及给药方法同前。实验结束时，将大鼠断头处死，取血置于低温离心机中,3500rpm，离心10分钟，取血清，采用双抗夹心ABC-ELISA法检测其中IL-1β、IL-2、IL-6的含量，采用巨噬细胞NO2释放法检测其中IFN-γ的含量；将胸腺和双侧肾上腺取出，在电子天平上称重，计算胸腺指数和肾上腺指数；采用中性红比色法测定腹腔巨噬细胞的吞噬功能；制备脾细胞悬液，检测淋巴细胞转化功能。 实验三、慢性束缚应激大鼠模型皮层和海马BDNF、TrkB、NT3的变化及中药复方的影响 大鼠分组和造模方法同实验一。实验目的为:①研究慢性束缚应激时大鼠皮层和海马的BDNF、TrkB、NT3变化；②对比三个复方对皮层和海马BDNF、TrkB、NT3的影响的异同。实验结束时，大鼠用10%的水合氯醛麻醉，4％多聚甲醛溶液通过心脏灌注固定后取脑，置于4％多聚甲醛溶液中后固定。然后将脑组织移至20％的蔗糖溶液中，待组织下沉后，液氮骤冷，于衡冷低温切片机中制备30μm的切片，用免疫组织化学结合图像分析的方法观察皮层和海马BDNF、TrkB、NT3的变化。 实验四、慢性束缚应激大鼠模型海马脑啡肽mRNA和前强啡肽mRNA的表达及中药复方的影响 分为正常对照组、7天模型组、21天模型组、逍遥散组、四君子汤组、金匮肾气丸组6组。研究目的为：①探讨慢性束缚应激时大鼠海马脑啡肽mRNA和前强啡肽mRNA表达的变化；②揭示三个复方抗应激的基因学基础，对比其对脑啡肽mRNA和前强啡肽mRNA的影响的异同。造模方法同实验一。造模结束后，立即将大鼠断头处死。在冰盘上迅速剥离脑组织取双侧海马，称重后用TRIZOL提取总RNA，进行RT-PCR反应，扩增脑啡肽和前强啡肽基因，同时以β-actin作为内对照。用凝胶图像分析系统进行扫描并分析，把目的基因的光密度与内参照条带的光密度的进行比较后进行半定量分析。 实验五、慢性束缚应激大鼠模型海马基因差异表达及逍遥散作用的初步研究 分为正