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连翘抗流感病毒有效物质基础研究黄连解毒汤有效部位的藏红花酸分析方法研究

赵文华  
【摘要】: 连翘为木犀科植物连翘Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl的干燥果实,为传统常用清热解毒药,主产于我国山西、河南、陕西、山东等地,味苦,无毒,性微寒,归肺、心、小肠经。具有清热解毒,消肿散结的功效。用于风热感冒,温病初起,温热入营,高热烦渴,神昏发斑,热淋尿闭等症的治疗。同时,连翘也是各中药复方(如银翘散等中)的主要组成药物。从银翘散的方源及其制方原则,结合药物的效用与抗病毒活性考察, 连翘为银翘散抗流感病毒的主要药物,且酚类成分为其主要的有效部位。 黄连解毒汤由黄连、黄芩、栀子、黄柏四味中药组成,具有清热泻火解毒之功效,主治一切实热火毒,三焦热盛之证。在对黄连解毒汤治疗缺血性中风的有效部位化学成分的分离鉴定中,得到了藏红花酸。国内外研究发现藏红花酸有广泛的药理活性,据文献报道,藏红花酸有清除氧自由基的作用 。因此在对其质量标准研究中考虑藏红花酸含量指标有其必要性。 本论文分四部分,分别对连翘抗流感病毒物质基础和黄连解毒汤有效部位的藏红花酸分析方法进行研究。 第一部分 连翘文献综述。对连翘的化学成分及生物活性进行综述,共引用文献67篇。 第二部分 连翘的实验研究 1. 建立了连翘有效部位的制备方法。首先优化了连翘有效部位的提取方法。以连翘中所含酚类及以连翘苷为指标,对连翘进行提取工艺考察,经数据分析,以酚类为指标进行测定,连翘有效部位提取的最佳工艺条件为:50%乙醇回流提取3次,每次1小时,溶剂用量为8倍。以连翘苷为指标进行测定,连翘有效部位提取的最佳工艺条件为:50%乙醇回流提取3次,每次1小时,溶剂用量为8倍。两结果基本一致,因此确定连翘有效部位提取的最佳工艺条件为:50%乙醇回流提取3次,每次1小时,溶剂用量为8倍。同时优化了大孔吸附树脂分离富集方法。以总酚类及连翘苷为指标,对树脂类型进行筛选,通过测定分析5种吸附树脂对总酚类及连翘苷的吸附特性,综合考虑多方面因素,AB-8对连翘有效部位中总酚类及连翘苷吸附量大,解吸容易,吸附后浸膏含量高,是一种性能良好的连翘有效部位的吸附剂。同时通过对AB-8应用工艺的研究,对其进行洗脱剂,柱床径高比,上样液浓度,吸附流速,洗脱流速洗脱体积等参数的考察,确定最佳树脂分离富集方法为:洗脱剂为50%乙醇,d/L为1/8的柱子,上样液浓度为0.1g/mL,用1mL/min的流速进行吸附。选择1mL/min的流速洗脱10BV。其方法简便,得率较高,可推广应用于生产。 2. 阐明了连翘抗流感病毒有效部位的主要化学成分。对连翘抗流感病毒有效部位进行提取、分离、得到15个单体化合物,运用各种色谱、光谱(包括UV、IR、EI-MS、FAB-MS、1HNMR、13CNMR等)技术及化学方法鉴定了其中的10个。其中苯乙醇苷4 个,分别是连翘酯苷、Forsythoside D、Forsythoside C、β-Hydroxyacteoside。黄酮1个,为芦丁。木脂素2个,分别是连翘苷、(+)松脂素-β-D-葡萄糖苷。有机酸2个,分别是咖啡酸、熊果酸。甾醇1个,为β-谷甾醇。鉴定的10个化合物均为首次从连翘有效部位中分离得到。其中β-Hydroxyacteoside为首次从连翘中分离得到的已知化合物。 WP=5 3. 采用可见分光光度法首次对连翘抗流感病毒有效部位中总酚类成分的总量进行了测定,并用从其有效部位中分离得到的具有代表性的两个成分连翘酯苷及芦丁进行定量分析。结果以连翘酯苷为指标性成分分析,连翘酯苷回归方程为y=1.2818x-0.0013,r =0.9998(n=7),表明连翘酯苷在范围0.022-0.66μg 之间与吸收度呈良好的线性关系。经测定,以连翘酯苷为指标性成分,有效部位总酚类成分含量为28.53%,RSD为2.81%,加样回收率为97.97%,RSD为1.42%;以芦丁为指标性成分分析,芦丁回归方程为y=0.0107x-0.0056,r=0.9998(n=5),表明芦丁在范围9.088-81.79μg/ml 之间与吸收度呈良好的线性关系。经测定,以芦丁为指标性成分,有效部位总酚类成分含量为91.07%,RSD为2.82%,加样回收率为98.35%,RSD为1.28%。 4. 建立了连翘抗流感病毒有效部位中的主要指标性成分连翘酯苷、连翘苷、芦丁的HPLC分析方法,并对样品进行了含量测定。连翘酯苷回归方程为y = 245399x +63339,r = 0.9998(n=5)。表明连翘酯苷在0.1515-1.01ug范围内与其色谱峰峰面积呈良好的线性关系。计算得连翘有效部位中连翘酯苷含量为11.65%,RSD为2.59%,加样回收率为100.79%,RSD为2.91%;连翘苷回归方程为y =806271x-1157.2,r = 0.9998(n=5),表明连翘苷在0.24-1.64μg范围内分别与其色谱峰峰面积呈良好的线性关系。计算得连翘有效部位中连翘苷含量为1.40%,RSD为2.47%,加样回收率为99.00%,RSD为2.53%;芦丁回归方程为y = 2827.3x-16.353,r = 0.9998(n=5),表明芦丁在0.15-0.60μg范围内分别与其色谱峰峰面积呈良好的线性关系。计算得连翘有效部位中芦丁含量为0.49%,RSD为1.24%,加样回收率为99.46%,RSD为2.99%。 第三部分 黄连解毒汤有效部位的藏红花酸分析方法研究 建立了黄连解毒汤抗脑缺血中风有效部位中藏红花酸的HPLC与TLC分析方法,并对样品进行了含量测定。采用HPLC法,藏红花酸回归方程为y = 10420x +18.943


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