腰痛舒胶囊对骨关节炎软骨保护机理的研究

【摘要】：骨关节炎(Osteoarthritis,OA)又称退行性关节炎,是关节软骨发生变性,继之邻 近软骨增生、骨化而形成的关节病变,是最常见的老年病。已有的研究重在软骨基质, 随着对其机制研究的深入,逐步认识到软骨细胞损伤,特别是软骨细胞凋亡与增殖平衡 紊乱是其主要机制,因此,对骨关节炎的研究应从软骨细胞着手。本研究即探讨腰痛舒 胶囊骨关节炎软骨保护作用及其机理。 研究目的 1 理论研究:探讨骨关节炎的病机特点 2 实验研究:腰痛舒胶囊对骨关节炎软骨的保护作用以及从软骨细胞凋亡与增殖的角度 探讨机制。 研究方法 1 分析骨关节炎的证候特征,结合历代医家对关节痛的认识,提出骨关节炎的病机特点。 2 按 Hulth 法造模 2 月与 5 月,造成大鼠膝骨关节炎早期与中期模型,分别用高、中、 低剂量的腰痛舒胶囊灌胃治疗 2 月,取材,进行肉眼大体观察与 X 线摄片后,分别取胫 骨平台内侧、股骨髁处软骨,利用光镜、扫描电镜、透射电镜、流式细胞仪、免疫组化, 对软骨组织积分、凋亡率、软骨表面超微结构、以及Ⅱ型胶原的分布进行观察,并通过 对软骨表达的P53、Bcl-2、PCNA、 TGF-β1以及血清NO、IL-1、TNF-α检测,探讨其作 用机理。 3 通过建立软骨细胞体外培养体系,探讨腰痛舒胶囊对软骨细胞凋亡/增殖及其合成代 谢功能的影响。 3.1 利用硝普钠(SNP)、TNF-α诱导软骨细胞凋亡,观察腰痛舒含药血清对软骨细胞凋 亡的影响,采用 Annexin v/PI 双参数法及透射电镜对软骨细胞凋亡进行定量、定性检 测。 3.2 用 MTT 法观察腰痛舒胶囊对正常培养的软骨细胞增殖的影响 3.3 采用同位素标记 3H-TdR、3H-Pro、35S-Na2SO4掺入法测定软骨细胞 DNA 含量、以及 合成胶原、蛋白多糖的功能,观察腰痛舒胶囊对凋亡状态下软骨细胞合成代谢功能的情 况。 研究结果 1 肾虚络阻是骨关节炎的主要病机特点。 2 以补肾通络法组方的腰痛舒胶囊对骨关节炎软骨退变有保护作用。利用 Hulth 法造成 骨关节炎模型,通过比较腰痛舒不同剂量组以及壮骨关节丸对模型关节软骨的外观、X 线影象、组织学评分、软骨表面结构、胶原分布的变化,观察到造模 2 月后模型组大鼠 关节软骨明显失去原有光泽,发黄,可见少量糜烂点,软骨面周围有滑膜增生。5 月后 关节明显粗大,软骨明显失去原有光泽,发黄,色泽变暗淡,软骨表面不规则,周围滑 WP=5 2 腰痛舒胶囊对骨关节炎软骨保护机理的研究 膜明显增生。腰痛舒高、中剂量组关节软骨颜色、光滑度、滑膜增生等均好于模型组。 造模5月X线可见侵蚀性软骨损害、软骨丢失和结构破坏,符合中期骨关节炎的影象 特征,用药组在X线影象上与模型组有明显差异,特别是腰痛舒高、中剂量组均未见明显 的侵蚀性软骨缺损,提示腰痛舒胶囊能明显延缓膝骨关节炎模型中的软骨退变,以高、 中剂量组尤为显著。 HE 染色造模 2 月软骨表层软骨变薄、粗糙,移行层细胞排列不规则,有簇集样增生 现象;5 月后软骨表面有明显凹陷,结构难以分辨,严重的表层消失。按照软骨损伤的 Mankin 法评分,造模 2 月模型组积分显著升高,腰痛舒中、高剂量组较模型组相比明显 下降(P0.01),较壮骨关节丸组相比也明显下降(P0.01),腰痛舒中、高剂量组之间无 显著差异,提示对早期骨关节炎中、高剂量的腰痛舒胶囊对软骨损伤有明显疗效。造模 5 月后模型组软骨损伤积分较造模 2 月明显升高(P0.01),而用腰痛舒高、中、低剂量 的大鼠软骨损伤积分均较模型组明显下降(P0.01-0.05),腰痛舒中、高剂量组且明显 优于对照药壮骨关节丸组。 Masson 染色显示,模型组软骨层胶原着色明显变淡,有的甚至不着色,潮线消失, 有的软骨表层有紊乱的胶原附着。腰痛舒高、中剂量组胶原着色较模型组明显加深,腰 痛舒低剂量组、对照组与模型组胶原着色在镜下无明显差异。 透射电镜观察到造模二月的模型组软骨细胞有凋亡现象,胶原纤维部分增粗, 排列 紊乱,但用药组间在透射电镜的表现上难以区分差异。 扫描电镜观察到正常组软骨表面光滑,似覆盖一层无定形物质,垄形结构完整,无胶 原暴露。造模5 月,软骨表面暴露胶原纤维,排列较不规则,形成流水冲蚀样改变。有的胶 原纤维网增粗、断裂、剥脱甚则翻起,软骨表面可见散在凹塌。腰痛舒的中、高剂量组 软骨表面的损伤较模型组明显减轻。 模型组软骨切片经Ⅱ型胶原免疫组化染色发现:软骨浅层区域染色加深,为深褐色, 着色区颜色不均匀,还可见到一圈淡染区。腰痛舒高、中剂量组均见浅层细胞数增加, 着色加深。提示腰痛舒能促进胶原的合成。 3 通过流式细胞仪和细胞凋亡的检测,模型组软骨凋亡率明显高于正常组,腰痛舒各组 凋亡率明显下降,表明腰痛舒对软骨的保护作用与抑制软骨凋亡有关。同时对造模后大 鼠血清NO、IL-1α、TNF-α进行检测,发现造模后一周的各组大鼠血清NO、IL-1α、TNF- α均浓度较正常对照组显著升高(P0.01),用药二月后,各组大鼠血清 NO、IL-1α、 TNF-α浓度较刚造模后时明显降低(P0.01),提示腰痛舒对软骨凋亡的影响可能与降低 NO、IL-1α、TNF-α有关; 4 造模后在软骨移行层见到 P53、Bcl-2 的表达增加;用腰痛舒后 Bcl-2 的表达有逐渐 增强的趋势,其中以腰痛舒高剂量组表达尤