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复方鳖甲软肝片治疗酒精性肝纤维化的实验研究

李健  
【摘要】:目的:近年来,我国酒精性肝纤维化的发病人数呈上升的趋势。有报道表明,在持续饮酒 10-20 年的人群中,酒精性肝纤维化的发病率为 20%。如今,酒精性肝纤维化作为临床独立的肝病类型受到研究者高度重视。虽然有多家研究机构长期致力于酒精性肝纤维化的研究工作,但仍有许多病理环节、机制不为我们所知。更深入的研究工作仍需要进一步开展。为此,本实验以酒精性肝纤维化大鼠模型为实验对象,研究实验性酒精性肝纤维化的主要病理机制,探讨中医“毒损肝络”致“肝络病”的病机及物质、结构基础,为中西医结合防治酒精性肝纤维化提供理论基础和动物实验的资料。方法:1.健康 SD 大鼠共 180 只,采用“白酒-吡唑-玉米油”混合物(比例为1000:250:3)灌胃配合饲喂高脂饲料的方法制备大鼠酒精性肝纤维化动物模型。分别于造模 4w、8w、12w、14w 和 16w 随机采血,分别检测血清 ALB、TP、AST、ALT、HA、ColⅣ、LN 含量;取大鼠肝组织常规石蜡包埋、切片行 HE 染色、Mallory 染色、天狼猩红染色,常规冰冻切片行油红 O 染色、糖原染色; 2.以正常大鼠做阴性对照,采用生化分析方法检测酒精性肝纤维化早期(造模 16w),大鼠肝组织匀浆中GSH、MAD和HYP含量;采用超薄切片、透射电镜观察肝血窦结构及肝窦内皮细胞的结构特点;采用免疫组化法检测肝组织Ⅰ、Ⅳ型胶原及LN蛋白表达;采用原位杂交法检测肝组织MMP-9mRNA及TIMP-1mRNA表达;采用Western-blot法检测肝组织TGF-β1蛋白含量;分离纯化大鼠肝Kupffer Cell,采用Western-blot法检测了Kupffer Cell中TNF-α和TGF-β1蛋白的表达; 3.造模结束(16w)后,大鼠随机分成 6 组:A. 模型组(生理盐水代替药物灌胃),B. 阳性药治疗组(秋水仙碱),C. 复方鳖甲软肝片高剂量治疗组,D. 复方鳖甲软肝片中剂量治疗组,E. 复方鳖甲软肝片低剂量治疗组,F. 阴性对照组(正常大鼠生理盐水灌胃),治疗 8w后取材。采用生化分析的方法检测血清ALB、TP、AST、ALT、CⅣ、LN含量及肝组织匀浆中GSH、MAD和HYP含量;测定大鼠肝门静脉管径和肝门静脉压力;肝组织常规石蜡切片HE染色、Mallory染色;肝组织石蜡切片Ⅳ型胶原及LN免疫组化染色;肝组织TGF-β1蛋白含量Western-blot分析; 4.采用 SPSS10.0 软件对相关实验数据进行统计学处理,求平均数,作单因素方差分析。 结果:通过以上实验得到下列结果: 1.酒精性肝纤维化启动或进行阶段,血清中 AST/ALT 比值及 HA 含量显著升高; 2.酒精性肝纤维化发生过程中伴随肝细胞脂肪、糖和蛋白质代谢紊乱; 3.实验性酒精性肝纤维化与CCl4等诱发的肝纤维化存在不同的发病机制,其主要病理特征是肝窦毛细血管化和窦周纤维化; 2 复方鳖甲软肝片治疗酒精性肝纤维化的实验研究 4.Kupffer Cell活化是酒精性肝纤维化启动的关键“分子事件”,TNF-α高表达是 Kupffer Cell活化的分子标志;酒精性肝纤维化早期Kupffer Cell是TGF-β1的主要来源 细胞; 5.肝窦毛细血管化和窦周纤维化形成过程中,自由基损伤、基膜成分的过表达、基 质金属降解酶及其抑制剂调节障碍等因素发挥主要作用; 6.从酒精性肝病病理机制得到“毒损肝络”致肝络病的病机假说:毒损肝络致肝络 病中医病机包括 3 个连续的病理阶段:络脉失养、气血郁滞、津凝痰结; 7.复方鳖甲软肝片抗酒精性肝纤维化的作用机制主要为: (1)促进机体产生大量抗氧化因子,提高机体对自由基的清除能力; (2)保护肝细胞,修复肝细胞损伤,降低转氨酶; (3)显著改善肝脏微循环,从而降低肝门静脉压力,预防由于门脉高压引发的 并发症; (4)显著降低动物血清中 HYP、Ⅳ型胶原及 LN 水平,因而能有效阻止肝窦毛 细血管化和窦周纤维化的进程; (5)通过干预TGF-β1蛋白表达及其信号传导途径而阻断肝纤维化的进行。 结论:通过统计学分析及各指标间关系的深入探讨,研究结论如下: 1.酒精性肝纤维化先后经历轻度酒精性脂肪肝、中度酒精性脂肪肝、重度酒精性脂 肪肝和轻度酒精性肝纤维化等病理过程,其主要特点是肝窦毛细血管化和窦周纤维 化; 2.酒精性肝纤维化形成过程伴随蛋白、糖、脂类物质代谢障碍以及自由基损伤、促 纤维生成细胞因子过表达、胶原酶及其抑制剂比例失调、基膜成分过度生成等多种 病理反应。其复杂性表明,酒精性肝纤维化存在多种病理环节,宜遵循综合疗法、 多靶点作用的治疗原则; 3.中医“毒损肝络”致“肝络病”的病机包含 3 个连续的病理阶段:(1)络脉失 养,(2)气血郁滞,(3)津凝痰结; 4.以活血化瘀和通络为立法的复方中药通过阻断多个纤维化病理环节,有效阻断了 肝纤维化的进行,在抗酒精性肝纤维化方面显示出良好的治疗效果。 关键词:病理机制,大鼠,肝络病,复方鳖甲软肝片, 酒精性肝纤维化


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