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小鼠痛刺激下左旋四氢巴马汀诱导与抑制基因的筛选

程伟  
【摘要】: 目的:应用抑制性消减杂交技术构建左旋四氢巴马汀镇痛诱导与抑制基因的cDNA扣除文库,克隆相关基因并在序列及查新分析的基础上期望获得与左旋四氢巴马汀镇痛相关的基因,为进一步的基因工程制药提供依据。方法:选用ICR雌性小鼠,热板致痛,给药组和不给药组分别提取小鼠脑组织mRNA,并逆转录为cDNA。对诱导基因的筛选采用以给药组为试验对象(Tester)以不给药组作为供试探针(Driver);反之,对抑制基因的筛选则以不给药组作为tester,以给药组作为供试探针。对通过正反扣除杂交后获得的基因片段构建cDNA扣除文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆扩增后进行斑点杂交筛选扣除文库,将筛选出的克隆进行测序及同源性分析。结果:诱导文库扩增后得110个白色菌落,抑制文库扩增后得66个白色菌落,经菌落PCR分析,分别得到35个和15个克隆,斑点杂交筛选得6个诱导和5个抑制插入片段,对所得差异表达基因片段测序,并进行同源性分析,共得3种已知功能基因序列,可能为左旋四氢巴马汀靶基因。结论:成功构建了左旋四氢巴马汀镇痛诱导与抑制基因的cDNA扣除文库,为今后进一步分析、研究左旋四氢巴马汀基因水平作用机制奠定了基础。


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