高压蒸制附子中酯型生物碱类成分变化规律的研究

【摘要】：附子为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaeli Debx.的子根的加工品，具有回阳救逆、补火助阳、逐风寒湿邪的功效。附子生用有大毒，多炮制加工降毒后入药。 本课题是国家十五攻关课题“含乌头碱中药附子理中丸安全性评价的示范研究”中有关附子炮制减毒的部分，主要通过不同炮制程度的高压蒸制附子中三种双酯型生物碱及其水解产物变化规律的研究，结合毒性和药效实验结果，揭示炮制对附子减毒存效(增效)的机理，优化炮制工艺，为制定附子饮片减毒增(存)效的多指标综合评价体系提供依据。 本课题主要进行了以下6个方面的研究： 1、通过古今文献研究，对附子的历史沿革、化学、药理、毒理、炮制及临床应用等相关领域进行了综述，为制定切实可行的实验方案奠定了坚实的基础。 2、收集了3个地区的附子饮片共21个样品，通过传统的性状比较和HPLC法测定三种双酯型生物碱(乌头碱、新乌头碱、次乌头碱)的含量来考察它们的质量。结果各样品间外观性状差别不大，但内在成分含量却存在一定的差异，其中黑顺片的含量在0.01～0.12mg／g之间，白附片含量在0～0.11mg／g之间。含量相差十倍多。提示：仅凭外观性状不能确定附子饮片的质量优劣及毒性大小，必须与成分检测结合起来。 3、为了更全面的考察原药材的质量，建立了附子饮片的HPLC指纹图谱方法，共分离得到13个共有峰，各主要色谱峰得到了较好的分离，该指纹图谱方法具有比较好的稳定性和重复性，三种双酯型生物碱均达到良好的基线分离。可以同时用来定性和定量。以HPLC指纹图谱的峰面积来计算三种双酯型生物碱的含量，对四川江油7个产地的生附片进行了含量测定，结果7个样品中只有一个含量为0.7mg／g，其余含量均在1～1.5mg／g之间，为此不同产地生附片的质量也存在一定的差异，应该通过规范化的炮制加工使它们达到稳定的质量才能应用于临床。 4、分别对三种双酯型生物碱进行了不同时间的水解，以HPLC指纹图谱为检测方法，通过液—质联用技术对水解后的产物进行结构鉴定，共鉴定出其中的9种化合物，分别为三种双酯型生物碱及其相应的三种单酯型生物碱和三种胺醇型生物碱。同时在三种双酯型生物碱的水解过程中，还发现有其它的水解产物，其中的Me-2、Ac-2和Hy-2的性质很不稳定，随着水解时间的延长而迅速消失。对于这些水解产物的水解过程和转化规律目前尚不清楚，有待于进一步研究。 5、通过预试验，对高压蒸制附子的几个基本工艺参数进行了优选。在此基础上，采用正交试验法，以三种双酯型生物碱的含量为指标，筛选了高压蒸制附子炮制减毒的最佳工艺，并进行了验证试验，初步建立了高压蒸制附子的工艺技术参数。 6、依据筛选的高压蒸制附子炮制减毒的最佳工艺，制备不同蒸制时间的制附片，应用HPLC指纹图谱对其中的主要成分进行定量和半定量分析，考察高压蒸制附子中主要成分随蒸制时间的变化规律。结果表明随着加热时间的延长三种双酯型生物碱的含量明显降低甚至检测不到；而三种单酯型生物碱则呈现出先增加后减少的变化趋势，同时在蒸制到40min～90min的过程中，三种双酯碱和三种单酯碱均出现了一个相对平衡期。据此结果，选择了7个有代表性的制附片样品进行毒性和药效实验，以进一步筛选低毒高效的高压蒸制附子的最佳工艺，建立附子饮片减毒增(存)效的多指标综合评价体系。 本课题首次对三种双酯型生物碱进行了不同时间的水解，采用液一质联用技术鉴定了9种化合物，并将水解产物一三种单酯型生物碱作为新的指标性成分，建立了能同时分析双酯型生物碱和单酯型生物碱的HPLC指纹图谱，对合理、有效地控制含乌头碱类的中药质量具有实用价值。同时系统的筛选了高压蒸制附子的基本工艺参数，分析了不同蒸制时间的附子中主要成分的变化规律，为结合毒性和药效实验结果，优化附子饮片的炮制新工艺，制订附子饮片减毒增(存)效的多指标综合评价体系奠定了基础。同时也对其它含乌头碱类毒性中药的安全性评价研究起到良好的示范作用。